Genetycznie zmodyfikowany szczep probiotyczny jako potencjalna metoda ograniczania występowania Salmonella u drobiu

Bakterie z rodzaju Salmonella należą do głównych przyczyn zakażeń przenoszonych przez żywność, a jednym z istotnych źródeł narażenia człowieka pozostają mięso drobiowe i jaja. Według danych przytoczonych przez autorów publikacji w Stanach Zjednoczonych każdego roku dochodzi do około 1,35 mln zakażeń Salmonella, przy czym szacuje się, że blisko 30% przypadków salmonellozy jest związanych ze spożyciem produktów drobiowych. Zdolność tych bakterii do kolonizacji przewodu pokarmowego jest związana między innymi z obecnością fimbrii typu 1, które umożliwiają przyleganie do komórek nabłonka jelitowego dzięki adhezynie FimH, rozpoznającej receptory zawierające mannozę na powierzchni komórek gospodarza. Autorzy badania postanowili wykorzystać ten mechanizm do opracowania szczepu probiotycznego, który dzięki zwiększonej zdolności adhezji mógłby skuteczniej zajmować dostępne miejsca przylegania, utrudniając tym samym kolonizację jelit przez patogenne szczepy Salmonella. Takie działanie określa się mianem wykluczania konkurencyjnego i, w przeciwieństwie do bezpośredniego działania przeciwdrobnoustrojowego, polega ono na ograniczaniu możliwości zasiedlania określonego środowiska przez patogeny.

Opracowanie szczepu o zwiększonej zdolności adhezji

Podstawą badań był szczep probiotyczny Escherichia coli Nissle 1917, który poddano modyfikacji genetycznej poprzez wprowadzenie genów odpowiedzialnych za wytwarzanie fimbrii typu 1 pochodzących od Salmonella Typhimurium. Wcześniej naukowcy skonstruowali szczep S. Typhimurium BJ3716 o ograniczonej zdolności wnikania do komórek gospodarza i przeżywania wewnątrz nich, ale zachowujący wysoką adhezję, co pozwoliło wykorzystać go jako punkt odniesienia w dalszych doświadczeniach. Ostatecznie otrzymano szczep E. coli Nissle 1917 pBDJ451, zawierający plazmid z genami fimbrii typu 1 oraz genem asd, uczestniczącym w syntezie składnika ściany komórkowej bakterii. Zastosowana konstrukcja umożliwiała utrzymywanie plazmidu bez konieczności stosowania antybiotyków jako czynnika selekcyjnego, a jej stabilność potwierdzono w doświadczeniu obejmującym 50 pokoleń bakterii, po których około 94% populacji nadal zachowywało plazmid. Autorzy nie ocenili jednak bezpośrednio możliwości przenoszenia go na inne bakterie.

Zwiększona adhezja i konkurencja z patogenami

Zdolność zmodyfikowanego szczepu do przylegania oceniono w doświadczeniach z wykorzystaniem komórek HeLa, wykazując, że E. coli Nissle 1917 pBDJ451 charakteryzował się około 5,2-krotnie większą adhezją niż wcześniej opracowany, silnie adherujący szczep S. Typhimurium BJ3716. Różnica ta była istotna statystycznie (p = 0,0004), co potwierdziło skuteczność zastosowanej modyfikacji w zwiększaniu zdolności przylegania do komórek w badanym modelu. W kolejnych doświadczeniach sprawdzono, jak zmodyfikowany probiotyk radzi sobie w bezpośredniej konkurencji z patogennymi szczepami S. Typhimurium SL1344 i DT104. Gdy bakterie jednocześnie przylegały do komórek, liczba związanych komórek probiotyku była odpowiednio 143- i 185-krotnie większa niż liczba komórek patogennych, co wskazywało na jego znaczną przewagę w konkurencji o miejsca adhezji. Udział fimbrii typu 1 w tym procesie potwierdzono dodatkowo w testach aglutynacji drożdży, w których zarówno mannoza, jak i przeciwciała skierowane przeciwko fimbriom Salmonella hamowały reakcję.

Choć wyniki potwierdziły zwiększoną zdolność przylegania zmodyfikowanego szczepu, należy uwzględnić, że doświadczenia przeprowadzono na ludzkich komórkach HeLa, a nie na komórkach nabłonka jelitowego drobiu, przez co nie odzwierciedlały one w pełni warunków panujących w przewodzie pokarmowym ptaków.

Ograniczenie liczebności Salmonella u drobiu

Skuteczność opracowanego szczepu oceniono następnie w doświadczeniach na brojlerach, indykach i kurach nioskach, którym podawano doustnie zmodyfikowany probiotyk przed zakażeniem wybranymi szczepami Salmonella. Grupę kontrolną stanowiły ptaki otrzymujące niemodyfikowany szczep E. coli Nissle 1917, co pozwoliło porównać wpływ zastosowanej modyfikacji na ograniczanie liczebności patogenów.

U brojlerów liczebność Salmonella w wymazach z kloaki wynosiła około 5×10³ CFU w grupie kontrolnej, podczas gdy u ptaków otrzymujących zmodyfikowany probiotyk stwierdzano około 4×10² CFU. Podobne tendencje obserwowano u indyków, a w obu doświadczeniach zmniejszał się również odsetek ptaków z dodatnimi wynikami badań mikrobiologicznych. Pomimo wyraźnych różnic liczbowych nie osiągnęły one jednak istotności statystycznej, dlatego nie można traktować ich jako jednoznacznego potwierdzenia skuteczności opracowanego szczepu. Badania przeprowadzone na kurach nioskach obejmowały zakażenia S. Typhimurium i S. Enteritidis oraz ocenę obecności patogenów w jelitach, jajowodach i na powierzchni skorup jaj. Zaobserwowano ograniczenie kolonizacji jajowodów oraz zanieczyszczenia skorup, co ma szczególne znaczenie dla bezpieczeństwa produkcji jaj. W zbiorczym zestawieniu doświadczeń na drobiu autorzy przedstawili zmniejszenie liczebności Salmonella od 10 do 100 razy, odpowiadające redukcji o około 90-99%, przy czym wielkość tego efektu zależała od badanej grupy ptaków i rodzaju materiału, a nie wszystkie różnice były istotne statystycznie.

Znaczenie wyników i ograniczenia badań

Zdaniem autorów głównym mechanizmem działania opracowanego szczepu jest wykluczanie konkurencyjne, polegające na zajmowaniu miejsc przylegania do komórek gospodarza, choć nie można wykluczyć udziału innych procesów, takich jak konkurencja o składniki odżywcze czy oddziaływanie na mikrobiotę jelitową. W przeprowadzonych doświadczeniach nie określono jednak, w jakim stopniu poszczególne mechanizmy odpowiadały za obserwowane ograniczenie liczebności patogenów.

Istotnym ograniczeniem badań jest niewielka różnorodność szczepów Salmonella wykorzystanych w doświadczeniach na zwierzętach, przez co nie wiadomo, czy podobne efekty można uzyskać wobec innych szczepów i serowarów występujących w produkcji drobiarskiej. Ponadto zmodyfikowany probiotyk podawano przed zakażeniem, dlatego wyniki odnoszą się przede wszystkim do zapobiegania kolonizacji jelit, a nie eliminowania wcześniej utrwalonego nosicielstwa. Przed praktycznym zastosowaniem konieczne będzie również określenie optymalnej dawki, trwałości kolonizacji jelit oraz bezpieczeństwa biologicznego zmodyfikowanego szczepu.

Źródło: https://www.mdpi.com/2304-8158/15/20/3626