Potrzeba nowoczesnych i wiarygodnych metod badawczych

Bezpieczeństwo mikrobiologiczne żywności stanowi jeden z kluczowych filarów bezpieczeństwa żywności. Klasyczne metody referencyjne, oparte na hodowli drobnoustrojów, mimo swojej wysokiej wiarygodności, są czasochłonne i nie zawsze odpowiadają na potrzeby współczesnego przemysłu spożywczego, który działa w warunkach presji czasowej, logistycznej i ekonomicznej. W odpowiedzi na te wyzwania dynamicznie rozwijają się metody alternatywne, takie jak metody molekularne (LAMP, PCR), immunologiczne, przyspieszone metody klasyczne czy w pełni zautomatyzowane systemy hodowlane.

Samo wdrożenie metody alternatywnej nie jest jednak wystarczające. Aby wyniki badań były akceptowane przez organy nadzorcze, metody te muszą być odpowiednio zwalidowane
i zweryfikowane. W tym kontekście kluczową rolę odgrywają normy z serii ISO 16140, opracowane przez Międzynarodową Organizację Normalizacyjną (ISO) w ramach prac podkomitetu ISO/TC 34/SC 9 „Microbiology”.¹

Metody alternatywne w mikrobiologii żywności – korzyści i ograniczenia

Metody alternatywne w mikrobiologii żywności oferują szereg korzyści praktycznych, takich jak skrócenie czasu uzyskania wyniku, możliwość automatyzacji analiz oraz zmniejszenie nakładu pracy personelu laboratoryjnego. W praktyce przemysłowej przekłada się to na szybsze podejmowanie decyzji dotyczących zwolnienia partii produktu, ograniczenie kosztów magazynowania oraz lepszą kontrolę procesów produkcyjnych.

Jednocześnie literatura naukowa podkreśla, że metody alternatywne mogą różnić się od metod referencyjnych pod względem czułości, specyficzności czy odporności na efekt matrycy.²  Z tego względu ich stosowanie bez odpowiedniej walidacji lub weryfikacji mogłoby prowadzić do błędnych decyzji i obniżenia poziomu bezpieczeństwa żywności. Normy ISO 16140 stanowią odpowiedź na tę potrzebę, zapewniając ujednolicone i uznawane na arenie międzynarodowej podejście do oceny przydatności metod alternatywnych.

Seria norm ISO 16140 obejmuje zestaw dokumentów standaryzujących proces walidacji i weryfikacji metod mikrobiologicznych stosowanych w łańcuchu żywnościowym. Najistotniejsze z punktu widzenia praktyki laboratoryjnej są:

• ISO 16140-2 – dotycząca walidacji metod alternatywnych w odniesieniu do metod referencyjnych, którą wykonuje producent danego rozwiązania,
• ISO 16140-3 – odnosząca się do weryfikacji metod referencyjnych oraz zwalidowanych metod alternatywnych w pojedynczym laboratorium, którą wykonuje użytkownik.

Normy te są powszechnie wykorzystywane zarówno przez producentów testów jakościowych, jak i przez laboratoria badawcze, w tym laboratoria akredytowane przez Polskie Centrum Akredytacji (PCA).

Walidacja metod alternatywnych względem metod referencyjnych

Norma ISO 16140-2 stanowi podstawowy dokument nakreślający proces walidacji metod alternatywnych. Jej celem jest wykazanie, że metoda alternatywna daje wyniki równoważne lub lepsze niż wyniki uzyskiwane metodą referencyjną³. Metody referencyjne nie są już postrzegane jako „złoty standard”. Wiele danych walidacyjnych zgodnych z normą ISO 16140-2 wykazało lepszą skuteczność niż norma.

Proces walidacji zgodnie z ISO 16140-2 obejmuje dwa zasadnicze etapy. Pierwszym z nich jest badanie porównawcze metody, w którym wyniki uzyskane metodą alternatywną są bezpośrednio zestawiane z wynikami metody referencyjnej na próbkach tego samego rodzaju. Analizie podlegają między innymi takie parametry jak relatywna czułość, relatywna specyficzność, dokładność oraz granica wykrywalności.

Drugim etapem jest badanie międzylaboratoryjne, którego celem jest ocena powtarzalności
i odtwarzalności metody alternatywnej w różnych warunkach laboratoryjnych. Badania te pozwalają ocenić stabilność metody i jej odporność na zmienność wynikającą z różnic  w wyposażeniu, personelu czy warunkach środowiskowych.³

Przykłady z literatury naukowej pokazują skuteczność tego podejścia. W badaniach dotyczących walidacji alternatywnej metody liczenia Enterobacteriaceae zastosowano koncepcję profilu dokładności (accuracy profile), która umożliwia kompleksową ocenę jakości metody ilościowej zgodnie z wymaganiami ISO 16140.⁴ Z kolei walidacje metod opartych na real-time PCR dla Campylobacter spp. potwierdziły możliwość uzyskania wyników porównywalnych z metodami hodowlanymi przy znacznym skróceniu czasu analizy.⁵

Istotnym elementem walidacji metod alternatywnych są niezależne organizacje certyfikujące, które prowadzą formalne procesy oceny i zatwierdzania metod zgodnie z wymaganiami norm ISO 16140. Do najbardziej rozpoznawalnych należą programy NF VALIDATION (prowadzony przez AFNOR Certification) oraz MicroVal (koordynowany przez NEN – Niderlandzki Instytut Normalizacyjny).^{8, 9}

NF VALIDATION oraz MicroVal oceniają walidacje metod alternatywnych w oparciu o protokoły ISO 16140-2, a ich certyfikaty są powszechnie uznawane przez laboratoria, organy urzędowej kontroli żywności oraz jednostki akredytujące. Zatwierdzenie metody w jednym z tych programów stanowi dla laboratoriów istotne ułatwienie przy wdrażaniu nowych technik badawczych, ponieważ potwierdza ich równoważność z metodami referencyjnymi na poziomie międzynarodowym.

W praktyce laboratoryjnej certyfikacja NF VALIDATION lub MicroVal nie zwalnia z obowiązku weryfikacji metody zgodnie z ISO 16140-3, jednak znacząco upraszcza ten proces i zwiększa zaufanie do stosowanych rozwiązań analitycznych.

Norma ISO 16140-3 uzupełnia proces walidacji o etap weryfikacji metody w pojedynczym laboratorium. Jest to szczególnie istotne z punktu widzenia laboratoriów akredytowanych, które muszą wykazać, że metoda – nawet wcześniej zwalidowana – działa poprawnie w ich własnych, specyficznych warunkach.⁶

Weryfikacja zgodnie z ISO 16140-3 obejmuje ocenę podstawowych parametrów metody, takich jak powtarzalność wewnątrzlaboratoryjna, szacowany limit wykrywalności (eLOD) w przypadku metod jakościowych czy szacowany błąd systematyczny (eBias) dla metod ilościowych. Zakres weryfikacji jest proporcjonalny do ryzyka oraz planowanego zastosowania metody.

Praktyczne zastosowanie normy ISO 16140-3 zostało szeroko opisane w publikacjach naukowych, m.in. w kontekście weryfikacji metod PCR do wykrywania Listeria spp. i Listeria monocytogenes. Badania te pokazują, że prawidłowo przeprowadzona weryfikacja pozwala na bezpieczne wdrożenie szybkich metod molekularnych do rutynowej kontroli mikrobiologicznej.⁷

Znaczenie walidacji metod alternatywnych dla laboratoriów i branży spożywczej

Doświadczenia laboratoriów akredytowanych PCA oraz doniesienia branżowe wskazują, że metody alternatywne są coraz częściej stosowane w rutynowych badaniach żywności i próbek środowiskowych. Ich wykorzystanie doskonale wpisuje się w proaktywne podejście do bezpieczeństwa żywności, znane z systemów HACCP czy programów monitorowania środowiska produkcyjnego.

Kluczowym elementem pozostaje jednak rzetelna walidacja i weryfikacja metod, zgodna
z wymaganiami ISO 16140 oraz normy PN-EN ISO/IEC 17025. Tylko takie podejście pozwala zachować równowagę pomiędzy innowacyjnością a wiarygodnością wyników badań.

Podsumowanie

Normy ISO 16140-2 i ISO 16140-3 stanowią fundament bezpiecznego
i odpowiedzialnego wdrażania metod alternatywnych w mikrobiologii żywności. Dzięki nim możliwe jest wykorzystanie nowoczesnych, szybkich technik analitycznych bez obniżania poziomu bezpieczeństwa żywności. W dobie rosnących wymagań jakościowych i regulacyjnych walidacja metod alternatywnych staje się nie tylko wymogiem formalnym, ale również narzędziem realnie wspierającym zarządzanie bezpieczeństwem żywności.

Neogen większość swoich mikrobiologicznych metod alternatywnych poddał procesów walidacji zgodnie z normą ISO 16140-2 udowadniając tym samym, że metody te są równocenne z metodami referencyjnymi, zgodnie ze wskazaniem w zakresie walidacji. Dla przykładu płytki Neogen Petrifilm® posiadają 16 walidacji na zgodność z ISO 16140, a testy do detekcji molekularnej systemu MDS, oparte na technologii LAMP do większości patogenów. To nie wszystko, ponieważ Neogen wyznacza nowe standardy walidacyjne wprowadzając protokół jednopłytkowy dla niektórych płytek Petrifilm, np. Szybkie płytki Neogen Petrifilm do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów (Neogen Petrifilm RAC), szybkie płytki Neogen Petrifilm do oznaczania liczby pleśni i drożdży (Neogen Petrifilm RYM) lub szybkie płytki Petrifilm do oznaczania liczby Enterobacteriaceae i nie tylko (sprawdź Food industry - NF Validation EN; Issued certificates | Microval). Dodatkowo Neogen, jako producent nowych i szybkich rozwiązań włącza w walidację urządzenia, np. czytnik płytek Petrifilm Plate Reader Advanced do liczenia kolonii lub system MDS do amplifikacji i interpretacji wyników dla patogenów.

Barbara Szuman

Potrzebujesz więcej informacji o monitorowaniu patogenów w środowisku produkcyjnym? Dołącz do webinaru Zero tolerancji w zarządzaniu ryzykiem: Nowoczesne metody wykrywania i interpretacji obecności patogenów w środowisku produkcyjnym.

Bibliografia

1. ISO/TC 34/SC 9: Microbiology of the food chain – documents and reports of the ISO subcommittee. International Organization for Standardization, Genewa. Dostęp online: https://www.iso.org/committee/47950.html
2. Law, J. W. F., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H., Rapid methods for the detection of foodborne pathogens: principles, applications, advantages and limitations, Frontiers in Microbiology, 2015.
3. ISO 16140-2:2016: Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method. International Organization for Standardization, Genewa, 2016.
4. Boulanger, B., et al., Validation of an alternative method for counting Enterobacteriaceae in foods based on accuracy profile, International Journal of Food Microbiology, 2009.
5. Malorny, B., et al., Validation according to ISO 16140 of a real-time PCR-based method for detecting Campylobacter in foods, International Journal of Food Microbiology, 2014.
6. ISO 16140-3:2021: Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference methods and validated alternative methods in a single laboratory. International Organization for Standardization, Genewa, 2021.
7. Ricchi, M., et al., Verification of a rapid PCR method for detection of Listeria according to ISO 16140-3, Pathogens, 2024.
8. NF Validation: Food industry – NF Validation EN. AFNOR Certification. Dostęp online: https://nf-validation.afnor.org
9. MicroVal: Issued certificates. Dostęp online: https://www.microval.org