Rejestracja do katalogu firm

Przypomnij hasło

Facebook Twitter LinkedIn

Wycofanie produktu spożywczego z rynku! Jak odpowiednio wcześnie wykryć skażenie żywności Salmonellą?

Kategoria: Bezpieczeństwo Żywności

MASOWE WYCOFANIA

Gram-ujemne pałeczki z rodzaju Salmonella są głównym z ponad 30 patogennych czynników zakażających żywność. W ostatnich miesiącach w branży spożywczej mieliśmy do czynienia z masowym wycofaniem ze sprzedaży produktów w wyniku wykrycia ich skażenia bakterią Salmonella Agona. Na skutek zanieczyszczenia sproszkowanego mleka dla dzieci, wyprodukowanego przez francuski koncern mleczarski Lactalis, zatruło się 39 niemowląt. W konsekwencji, decyzją tamtejszych organów kontrolujących bezpieczeństwo żywności, zadecydowano o wycofaniu z rynku aż 12 milionów produktów koncernu. Fabryka firmy  znajdująca się w Craon we Francji, gdzie wykryto ognisko skażenia, została zamknięta. Po przeprowadzeniu pełnego dochodzenia okazało się, że producent nie zastosował wszystkich procedur bezpieczeństwa ani nie wycofał odpowiednio wcześnie produktów ze sprzedaży. Najprawdopodobniej bakterie będące powodem zakażenia bytowały w środowisku fabryki przez całe lata - niewykryte.

Skala strat finansowych oraz wizerunkowych ponoszonych przez ten koncern uzmysławia, jak dalekie mogą być konsekwencje niezachowania higieny procesu produkcyjnego oraz procedur bezpieczeństwa przez producentów żywności. Pokazuje to konieczność jak najdokładniejszego przestrzegania norm badania mikrobiologicznego żywności.

Jak więc odpowiednio i skutecznie wykrywać Salmonellę? W celu prewencji skażeń, próbki z obszaru łańcucha żywnościowego powinny być badane pod kątem obecności Salmonelli metodą znormalizowaną zgodną z normą PN-EN ISO 6579 bądź metodami alternatywnymi.

METODA ZNORMALIZOWANA

Metoda znormalizowana badania żywności pod kątem obecności Salmonella spp. opiera się na klasycznej hodowli na pożywkach i składa się z czterech etapów. Wstępny etap polega na 18-godzinnym namnażaniu i regeneracji uszkodzonych komórek w zbuforowanej wodzie peptonowej. Dla wyrobów z czekolady bądź kakao stosuje się wodę peptonową z dodatkiem kazeiny lub odtłuszczonego mleka oraz zieleni brylantowej w celu zahamowania wzrostu bakterii Gram-dodatnich.

Następnie próbki hoduje się równolegle w dwóch bulionach selektywno namnażających: Rapaport Vassiliadis z soją (RVS) oraz Müllera-Kauffmana (MKTTn).  Po okresie inkubacji, w celu izolacji kolonii Salmonella, hodowle posiewa się na dwie pożywki selektywno -różnicujące. Pierwszą z nich jest pożywka XLD, która opiera się na wykrywaniu zdolność komórek Salmonella do dekarboksylacji lizyny i wytwarzania siarkowodoru. Wybór drugiej pożywki pozostaje w gestii laboratorium. Świetnym wyborem są pożywki chromogenne, takie jak Brillance™ Salmonella. Brillance™ Salmonella to podłoże nowej generacji, w którym zastosowano innowacyjną technologię Inhibigen™. Dzięki temu na pożywce Brilliance™ Salmonella znacznie zredukowany jest wzrost mikroflory towarzyszącej, a wysoce selektywne chromogeny pozwalają na łatwe różnicowanie wyrosłych kolonii i uniknięcie fałszywie dodatnich wyników.

Podłoże chromogenne Brillance Salmonella OXOID

Charakterystyczne kolonie wyrosłe na pożywkach selektywno-różnicujących przesiewa się na agar odżywczy tak, aby uzyskać monokulturę, a następnie wykonuje badania potwierdzające. Badania potwierdzające obejmują testy biochemiczne oraz serotypowanie sprawdzające obecność antygenów somatycznych i rzęskowych. Czasochłonne, oparte na hodowli  badania potwierdzające można zastąpić metodami komercyjnymi dopuszczonymi również przez normę.   Przykładem takich rozwiązań jest szybki test aglutynacji lateksowej OXOID Salmonella Test Kit do wstępnej identyfikacji Salmonella spp. bezpośrednio z pożywek selektywnych i/lub selektywnych bulionów namnażających. Aglutynacja zachodząca w ciągu dwóch minut  wskazuje na obecność Salmonella w próbce. Salmonella Test Kit jest idealny również do skriningu próbek w przemyśle spożywczym, gdzie szybkie wyniki minimalizują opóźnienia związane z rutynowym badaniem zakażeń wywołanych przez Salmonella.

Kolejną metodą identyfikacji biochemicznej jest O.B.I.S. Salmonella - szybki skriningowy test zawierający dwie proste reakcje biochemiczne (wykrywające aktywność pyrazy i deaminazy) na jednym kartoniku testowym. Przeprowadzenie tych dwóch reakcji biochemicznych pozwala rozróżnić Salmonella spp. od innych drobnoustrojów o podobnej morfologii kolonii na podłożach selektywnych, w badanej żywności.

Test O.B.I.S. Salminella OXOID

Test RapID One OXOID

Innym rozwiązaniem do identyfikacji biochemicznej jest panel RapID™ ONE System firmy OXOID. Jest to jednoetapowy, manualny test do łatwej i szybkiej (4h) identyfikacji Salmonella. Każdy panel RapID™ ONE to plastikowa tacka ze zbiorniczkami zawierającymi liofilizowane substraty; po zaszczepieniu zbiorniczków zawiesiną bakteryjną substraty zostają uwodnione, w zbiorniczkach zachodzi reakcja i widoczne są zmiany zabarwienia. Kod uzyskany z indeksów numerycznych dla wyników ujemnych i dodatnich poszczególnych reakcji służy do identyfikacji badanego izolatu poprzez porównanie z bazą danych kodów.

METODY ALTERNATYWNE

Tradycyjna diagnostyka mikrobiologiczna próbek żywnościowych stosowana w laboratoriach jest bardzo praco- i czasochłonna, co jest spowodowane mnogością przesiewów i hodowli, różnych etapów identyfikacji – od morfologicznych, przez biochemiczne, po serologiczne. Szczególnego znaczenia nabierają zatem alternatywne metody pozwalające na szybkie wykrycie patogenów.

Wspomniana w opisie metody znormalizowanej pożywka Brilliance™ Salmonella Agar jest również elementem metody alternatywnej Precise™ Oxoid wykorzystywanej do szybszego, w porównaniu do tradycyjnych metod hodowlanych, wykrywania Salmonella w szerokim zakresie próbek żywności – wynik otrzymujemy w ciągu zaledwie 3 dni. Metoda ta posiada walidację AFNOR. Polega na użyciu jednej pożywki namnażającej, hamującej wzrost konkurencyjnej flory (One Broth Salmonella) , jednej chromogennej płytki selektywnej na której Salmonella wyrasta w postaci łatwo identyfikowalnych fioletowych kolonii (Brilliance™ Salmonella Agar) i jednego lateksowego testu potwierdzającego (Salmonella Latex Test).

Kolejną alternatywną metodą są testy Hygiena™ LFS Salmonella AD. Jest  to prosty, dokładny oraz niedrogi sposób wykrywania patogenu; nie wymaga specjalistycznego wyposażenia laboratoryjnego, a wyniki są szybkie i jednoznaczne. Zasada testu opiera się na immunochromatografii, w połączeniu z namnażaniem na pożywce w technologii fagowej. Pasek testowy, który jest umieszczany  w namnożonej próbce, zawiera przeciwciała wobec Salmonella, wiążące migrujący z próbką kompleks. Zachodząca reakcja uwidacznia się w postaci czerwonej linii wskazującej na dodatni wynik testu. Test LFS Salmonella AD przeznaczony jest do wykrywania obecności Salmonelli spp. w różnych rodzajach żywności: m.in. surowym mięsie drobiowym, mięsie czerwonym, wędlinach, warzywach, owocach, czekoladzie, proszku mlecznym, orzechach, paszach i popłuczynach tuszek.

Paski testowe LFS Salmonella AD

Bardzo precyzyjną metodą wykrywania Salmonella w żywności jest reakcja PCR w tym Real Time PCR. Otrzymany wynik jest obiektywny, ponieważ test opiera się na znajomości stałej struktury DNA sekwencji określonych nukleotydów, niezależnej od stanu fizjologicznego organizmu. Real Time PCR pozwala na wykrycie bakterii Salmonella bez potrzeby uzyskania czystej kultury. Izolację DNA z badanej próbki żywności można przeprowadzić manualnie, wykorzystując zestawy do ekstrakcji, bądź automatycznie – przy pomocy urządzeń z magnetyczną separacją, takich jak King Fisher™ Thermo Fisher Scientific™. Natomiast w laboratoriach pracujących z małą liczbą próbek sprawdzi się urządzenie KingFisher™ Duo Prime zapewniając wysoką wydajność, powtarzalność i niezawodność. Jeden cykl umożliwia izolację 24 próbek o objętości od 30μl do 5ml. Przy większej ilości próbek można zastosować urządzenie KingFisher™ Flex, który pozwala na jednorazową izolację aż 96 próbek. Przeprowadzając automatyczną izolację DNA otrzymuje się próbki wyizolowanego DNA/RNA/białek o wysokiej jakości i czystości, przy minimalnym nakładzie pracy.

 

KingFisher Flex

KingFisher™ Duo Prime

Pathatrix

W równoległym badaniu wielu próbek można zastosować urządzenie do łączenia i zagęszczania wstępnie namnożonych próbek. System Pathatrix® selektywnie wiąże i koncentruje patogeny dając możliwość łączenia do 10 próbek w jedną, dzięki czemu redukuje koszty badań nawet o 90%. Wykorzystanie opłaszczonych przeciwciałami kuleczek magnetycznych zapewnia izolację specyficznych bakterii spośród flory towarzyszącej i jednocześnie oczyszcza próbkę z inhibitorów reakcji PCR.

Po etapie izolacji DNA, amplifikacja oraz detekcja patogenów zachodzą w termocyklerze w ciągu kilkudziesięciu minut. Jednym z najbardziej uniwersalnych urządzeń na rynku jest termocykler Applied Biosystems® 7500 Fast Real-Time PCR. Wiele kanałów detekcji oraz możliwość kalibracji barwników we własnym zakresie, pozwala na przeprowadzanie badań w różnych kierunkach. Dla diagnostyki Salmonella zaprojektowano gotowe zestawy testowe. Zestaw MicroSEQ® Salmonella zawiera gotowe do użycia, zliofilizowane odczynniki w postaci tabletek umieszczonych od razu w probówkach reakcyjnych. Dzięki temu omija się pracochłonny etap przygotowywania mieszaniny reakcyjnej, a ryzyko przypadkowej kontaminacji próbek zostaje znacząco zmniejszone. O najwyższej jakości tych testów świadczą certyfikaty AOAC oraz AFNOR. PCR to metoda bardzo szybka - całkowity czas wykonania oznaczenia wraz z namnożeniem próbki to zaledwie 18-24 godzin. Czułość jest dużo wyższa niż w przypadku metod tradycyjnych.

Innym rozwiązaniem mogącym mieć zastosowanie w diagnostyce Salmonella jest BAX®Q7- zamknięty system firmy DuPont, służący do szybkiej diagnostyki metodą Standard PCR i Real Time PCR. System przeznaczony jest dla użytkowników ceniących sobie prostotę obsługi dużych ilości badanych próbek. System BAX® X5 tego samego producenta oferuje te same szybkie, dokładne i łatwe w obsłudze rozwiązanie do wykrywania patogenów co BAX® Q7, ale w mniejszym formacie. Urządzenie BAX X5 umożliwia jednoczesne oznaczanie 32 próbek. Wykrywanie obecności Salmonella jest możliwe już w drugiej dobie, urządzenie posiada walidacje AFNOR i AOAC.

7500 Fast Real-Time PCR

Bax X5 oraz Bax X7

Jest niezwykle ważnym, aby producenci żywności i pasz mogli szybko i niezawodnie potwierdzić, że ich produkty są wolne od patogenów przenoszonych przez żywność, takich jak Salmonella, w celu zapewnienia bezpieczeństwa konsumentom. W rzeczywistości większość krajowych i międzynarodowych norm bezpieczeństwa żywności ma zerową tolerancję dla tego patogenu, co wymaga od producentów wykazania braku obecności w żywności gotowej do spożycia i środowisku przetwarzania przy użyciu jak najbardziej czułych i precyzyjnych metod. Spośród wymienionych powyżej technik badawczych laboratoria mogą wybrać najdogodniejszą dla siebie metodę, mając na uwagę ilość przeprowadzonych oznaczeń, sprzęt laboratoryjny jakim dysponują oraz ograniczenia czasowe. Należy pamiętać, że w każdej wymienionej technice kluczowe jest zapewnienie najwyższej jakości badań poprzez nadzór nad personelem, wyposażeniem i prowadzenie stałej kontroli uzyskiwanych wyników.

Zapraszamy do pobrania dokładnej specyfikacji testów diagnostycznych, a także szczegółów dotyczących przedstawionych technik wykrywania oraz oznaczania liczby Salmonella.

Argenta - Specyfikacja testów diagnostycznych Salmonella (pobierz)

 

Tagi: Badania żywności Przewodniki

Autor: Argenta

Argenta

Dorota Merlak, Marta Marciniak

Artykuł opublikowany dzięki firmie:

Zapisz się do newslettera

Bądź na bieżąco!

Zapisz się
Facebook Twitter LinkedIn