Rejestracja - czytelnik

Przypomnij hasło

Menu

Menu

Facebook Twitter LinkedIn

Jak najefektywniej wyposażyć laboratorium do badań w kierunku wykrywania i oznaczania liczby Listeria

Kategoria: Bezpieczeństwo Żywności

Wszechobecna w środowisku Listeria jest jednym z najważniejszych mikrobiologicznych kryteriów bezpieczeństwa środków spożywczych. Konieczność badania L. monocytogenes dotyczy zarówno żywności przeznaczonej dla niemowląt, żywności specjalnego medycznego przeznaczenia, żywności gotowej do spożycia, w której możliwy jest jej wzrost jak i tej, w której Listeria nie ma warunków do wzrostu w czasie całego okresu przydatności do spożycia (Rozporządzenie Komisji (WE) NR 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. wraz z późniejszymi zmianami).

W środowisku Listeria powszechnie znajdowana jest w: glebie, roślinach, warzywach w stanie rozkładu, wodzie, kiszonkach, w kale ludzi i zwierząt oraz w przewodzie pokarmowym zdrowych zwierząt będących nosicielami. Potencjalnym źródłem zanieczyszczenia pałeczką Listeria może być nawożenie roślin za pomocą kiszonek (kompostu) lub obornika, a także odchody ptaków i zwierząt. Mikroorganizmy mogą przedostawać się do przestrzeni produkcji żywności np. na butach pracowników oraz poprzez zanieczyszczone surowce. Takie cechy charakterystyczne jak zdolność wzrostu w temperaturze chłodniczej, tworzenie biofilmu, szybkie namnażanie w warunkach wilgotnych oraz zdolność przeżycia w środowisku wysoko zasolonym pomagają komórkom Listeria przeżyć w wielu miejscach i utrudniają jej skuteczną eliminację z przestrzeni produkcyjnej.

Aby rozpocząć badania w kierunku Listeria jak zawsze warto na wstępie określić parametry, które pozwolą wybrać najefektywniejszą metodę, a do tej metody dostosować wyposażenie laboratorium.

Aby wybrać odpowiednią metodę powinniśmy określić:

– rodzaje próbek, ze szczególnym uwzględnieniem charakteru matrycy, trwałości badanego produktu i zdolności Listeria do wzrostu w danej matrycy,

– cel badawczy: wykrywanie obecności czy oznaczanie liczby,

– spodziewaną liczbę próbek do badań,

– oczekiwany czas uzyskania wyniku, w tym wyniku dodatniego,

– możliwości sprzętowe laboratorium i czasowe personelu.

W zależności od zebranych danych możemy wybrać spośród kilku rodzajów metod badawczych:

– metody znormalizowanej,

– alternatywnej metody hodowlanej,

– metody zautomatyzowanej, np. PCR w systemie zamkniętym lub otwartym.

Po wyborze metody możemy przystąpić do określenia potrzebnego w laboratorium wyposażenia, na które wpływ ma np. to, czy pożywki przygotowujemy sami, czy kupujemy gotowe, lub docelowa automatyzacja pracy.

Metoda znormalizowana

Metoda znormalizowana PN–EN ISO 11290 zeszyt 1 i 2 jest metodą referencyjną oznaczania liczby i wykrywania Listeria, w tym L. monocytogenes. Zasada wykrywania obecności oparta jest na trzech następujących po sobie etapach: dwustopniowym namnażaniu próbki w bulionach selektywno-namnażających, hodowli na pożywkach selektywno-różnicujących oraz potwierdzeniu wyrosłych charakterystycznych kolonii w kilku testach lub za pomocą komercyjnie dostępnych paneli biochemicznych. Oznaczanie liczby realizowane jest za pomocą krótkiej regeneracji, hodowli na pożywce selektywno-różnicującej i potwierdzeniu charakterystycznych kolonii.

Pożywki – robimy sami czy kupujemy gotowe?

Ponieważ metoda wykorzystuje tradycyjną technikę hodowlaną, niezbędne do jej realizacji będą pożywki hodowlane, w tym duże objętości bulionu namnażającego. Przygotowanie pożywek z formy suchej wymagać będzie sprzętu dla pożywkarni o odpowiedniej wydajności, takich jak stacja uzdatniania wody, wagi, pH–metr, autoklaw(–y), łaźnia wodna do upłynniania pożywek oraz sterylizatory szkła.

Szczególnie newralgiczna jest tu wydajność autoklawu oraz możliwości czasowe personelu. Należy również pamiętać o potrzebie prowadzenia kontroli jakości wytwarzanych pożywek, w tym kontroli sterylności i mikrobiologicznym sprawdzeniu ich działania za pomocą szczepów testowych, w oparciu o normę PN–EN ISO 11133.

Dla dużych laboratoriów dobrym rozwiązaniem jest media preparator (fot.1), w którym można jednorazowo przygotować nawet do 30 litrów pożywki. W urządzeniu przeprowadza się całość procesu: rozpuszczanie pożywki w proszku, sterylizację, chłodzenie i ewentualne dodawanie suplementów. Wszystkie dane z przebiegu procesu mogą być eksportowane do komputera/tabletu/smartfona zewnętrznego i drukowane. Dzięki pomiarowi temperatury bezpośrednio wewnątrz pożywki, szybkiemu ogrzewaniu i chłodzeniu proces jest dużo szybszy i dokładniejszy od tradycyjnej metody, zużywa mniej energii i jest mniej pracochłonny. Również rozlewanie do probówek lub na płytki Petriego można całkowicie zautomatyzować przy pomocy pompy perystaltycznej lub dilutora o dodatkowej funkcji rozlewu.

Fot. 1. Media preparator jako alternatywa autoklawu (na zdjęciu Mediawel 30 z Alliance Bio Expertise)

Alternatywą dla pożywek przygotowywanych samodzielnie są pożywki w formie gotowej. Dla bulionu namnażającego Half Fraser mamy do wyboru worki z suchymi pożywkami do uwodnienia o pojemności aż do 20 l, gotowe worki 3 lub 5 litrowe, butelki np. po 225 ml. Worki są dobrym rozwiązaniem ze względu na mniejsze koszty utylizacji odpadów w porównaniu z butelkami, ale wymagają wykonywania odpowiedniej liczby badań, by zużyć całą pożywkę w przeciągu dopuszczonego przez producenta okresu ważności po ich otwarciu. Dla bulionu Frasera popularna forma gotowa to probówki po 10 ml, a dla pożywek agarowych płytki Petriego pakowane po 10 szt. W przypadku wyboru takiej opcji trzeba pamiętać o zapewnieniu przestrzeni do przechowywania w odpowiedniej temperaturze. Worki i butelki często nie wymagają przechowywania w temp. chłodniczej (dopuszczalna temp. do 25°C), natomiast dla płytek z gotowymi pożywkami niezbędne będzie posiadanie lodówek laboratoryjnych.

Używanie pożywek gotowych tylko na pierwszy rzut oka wydaje się droższe. Jeśli jednak uwzględni się całkowite koszty wybudowania, wyposażenia lub powiększenia pożywkarni oraz koszty eksploatacyjne przy autoklawowaniu, zmywaniu i sterylizacji szkła oraz kontroli jakości pożywek, może okazać się, że wariant z pożywkami gotowymi będzie efektywniejszy. Można również zastanowić się nad zaopatrzeniem laboratorium w pożywki w sposób mieszany, np. gdy mamy małą pożywkarnię i/lub nie jesteśmy w stanie dokładnie przewidzieć ilości próbek do badania. W takim przypadku posiadanie małej rezerwy pożywek suchych o długim okresie przydatności zabezpieczy nas przed ewentualnym brakiem gotowych odczynników w potrzebnej ilości.

Przygotowanie próbek analitycznych – dilutor czy waga?

Przygotowanie próbki analitycznej i zawiesiny początkowej wymaga naważenia x ilości próbki badanej oraz odmierzenia odpowiednio 9x objętości bulionu/rozcieńczalnika. Zawiesinę początkową przygotowujemy w workach do homogenizacji o odpowiedniej wielkości. Dla próbek, które tworzą zawiesinę o trudno opadających cząstkach, warto używać worków z filtrem (bocznym lub pełnym). Aby zmniejszyć praco- i czasochłonność tego etapu najefektywniej jest zastosować dilutor, który z dokładnością zalecaną przez metody znormalizowane (patrz ISO 6887 – wszystkie części, ISO 18593 oraz PN–EN ISO 7218) pozwoli naważyć próbkę oraz odmierzyć odpowiednią do masy próbki objętość rozcieńczalnika (fot.2). Czas takiej operacji z użyciem szybkiego dilutora to tylko 9 sekund. Przy zakupie dilutora warto rozważyć zakup urządzenia, które ma możliwość używania kilku pomp, co pozwoli przygotowywać zawiesiny początkowe z różnymi rozcieńczalnikami. Ważny jest również odpowiedni zakres pracy – dla dużych naważek (np. próbek łączonych) musimy zaopatrzyć się w urządzenie o większym zakresie pracy wagi, np. do 5 kg. Aby wygodnie operować workami z zawiesiną oraz pojemnikami/workami z rozcieńczalnikami/bulionami, można zaopatrzyć się w specjalne statywy oraz uchwyty przytrzymujące typu GecoGrip.

Fot. 2. Nowoczesny dilutor znacznie przyspiesza etap odważania próbki (Alliance Bio Expertise Diluwel)

Homogenizacja – stomacher

Homogenizację zawiesiny wykonujemy w homogenizatorach perystaltycznych zwanych potocznie stomacherami. Przy zakupie homogenizatora zwracajmy uwagę na sposób mycia elementów ruchomych, możliwość regulacji nacisku łopatek homogenizujących oraz poziom generowanego hałasu. Podobnie jak dilutor, stomacher musi być dostosowany do wielkości badanych próbek, a więc do pojemności worków do homogenizacji. Przy większej liczbie próbek warto pomyśleć o korzystaniu z minimum dwóch stomacherów jednocześnie. Zapewni to ciągłość pracy duetu dilutor – homogenizator.

Hodowla – ile cieplarek będzie nam potrzebnych?

Analizując schemat badawczy metody możemy zaplanować ilość potrzebnych cieplarek ze względu na wymagane temperatury inkubacji. W przypadku Listeria mamy dwie temperatury namnażania: 30±1°C lub 37±1°C oraz 37±1°C. Do potwierdzeń Listeria oraz L. monocytogenes metodami probówkowymi również potrzebna będzie temperatura 37±1°C (hemoliza, rozkład cukrów oraz opcjonalnie test CAMP–a i reakcja VP) oraz opcjonalnie 25±1°C do reakcji na zdolność do ruchu. Tak więc wymagane minimum to dwie cieplarki: na 37±1°C oraz na 30±1°C. Jeśli zdecydujemy się na szerszy zakres potwierdzeń, niezbędna będzie jeszcze trzecia cieplarka na 25±1°C.

Norma dopuszcza również stosowanie testów zminiaturyzowanych do biochemicznej identyfikacji Listeria monocytogenes. Takie komercyjne panele wymagają również inukubacji w przewidzianej przez producenta temperaturze, zazwyczaj w 37°C.

Poprawna praca cieplarki ma istotny wpływ na dokładność metody. Na rynku mamy duży wybór cieplarek w różnej klasie jakości. Przy zakupie, oprócz wyboru pojemności komory, warto zwrócić uwagę na takie parametry jak:

  • zakres temperatur – dostępne od +5°C powyżej otoczenia do +105°C,
  • zmienność temperatury w przestrzeni i w czasie,
  • rodzaj obiegu powietrza – grawitacyjny, wymuszony czy mieszany,
  • sposób ustawiania temperatury,
  • łatwość czyszczenia komory,
  • dodatkowe udogodnienia, np. szklane drzwiczki, dodatkowe porty do pobierania danych, włączniki i wyłączniki czasowe, alarm braku zadanej temperatury.

Jeśli chodzi o rodzaj obiegu powietrza, to im większa cieplarka i wyższy przewidywany stopień zapełnienia, tym obieg wymuszony będzie dawał lepsze parametry stabilności temperatury w przestrzeni komory. Na przykład dla 37°C w zaawansowanych technologicznie inkubatorach zmienność temperatury w przestrzeni dla obiegu grawitacyjnego może wynosić ± 0,6°C, podczas gdy dla wymuszonego tylko ± 0,2–0,4°C.

Utrzymanie komory w czystości ułatwia jej gładka powierzchnia ze stali nierdzewnej z zaokrąglonymi narożnikami oraz możliwość, bez udziału narzędzi, demontażu prowadnic półek.

W przypadku ograniczonej powierzchni w laboratorium warto rozważyć zakup inkubatorów z możliwością piętrowego ustawiania, bez konieczności użycia stelaża oraz z korzystnym stosunkiem podstawy urządzenia do jego objętości.

Możliwość zapisu danych z procesu będzie bardzo wygodną opcją przy sprawowaniu nadzoru nad procesem inkubacji.

Bezpieczna praca – komory laminarne

Zadaniem komory laminarnej potrzebnej w laboratorium badającym takie patogeny, jak Listeria jest:

  • ochrona operatora,
  • ochrona środowiska,
  • ochrona próbki,
  • zabezpieczenie przeciw zanieczyszczeniu krzyżowemu.

Wymogi te spełniają komory II klasy (A2). Wszystkie zaopatrzone są w filtry HEPA i wymuszony obieg strumieni powietrza, szybę chroniącą operatora i lampę UV do dezynfekcji przestrzeni roboczej. Powierzchnia ze stali nierdzewnej jest łatwa do utrzymania czystości.

Potwierdzenia – tradycyjnie czy komercyjnym panelem?

Fot. 3. Komercyjne testy biochemiczne pomagają zaoszczędzić miejsce w inkubatorach (Oxoid™ Microbact™ Listeria 12L Kit)

Norma daje nam możliwość wyboru między zestawem pojedynczych testów potwierdzających a panelem mikro reakcji biochemicznych (fot.3). Opcjonalnie zaleca również obserwację preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama lub preparatu mokrego. W takim przypadku potrzebny będzie mikroskop najlepiej z kontrastem fazowym. Mikroskop w laboratorium mikrobiologicznym to doskonałe narzędzie do wstępnej charakterystyki i identyfikacji wyrosłych kolonii w różnych metodach. Jest ciągle niezastąpiony w codziennej pracy.

Jak pisaliśmy już powyżej, do pojedynczych reakcji identyfikacyjnych, jak i do paneli komercyjnych potrzebne będą cieplarki. Na pewno o wiele więcej miejsca w cieplarkach zajmą osobne testy probówkowe, o czym warto pamiętać przy określaniu liczby potrzebnych cieplarek.

Wszystkie wymienione etapy badania wymagają również użycia drobnego sprzętu laboratoryjnego i materiałów jednorazowych, takich jak ezy bakteriologiczne o pojemności 10 µl, igły inokulacyjne, pipety automatyczne o pojemności nominalnej 1 ml i 10 ml, płytki Petriego o średnicy 90 mm lub 140 mm, rękawiczki jednorazowe i worki na odpady zakaźne.

Alternatywna metoda hodowlana

Stosowanie metod hodowlanych, alternatywnych w stosunku do metody znormalizowanej, staje się coraz popularniejsze ze względu na ich prostsze wykonanie i krótszy czas uzyskania wyniku. Dzięki zastosowaniu innowacyjnych bulionów namnażających i pożywek selektywno-różnicujących oraz różnych wariantów etapu potwierdzeń wynik ujemny uzyskuje się już po 48 godzinach badania.

Przeważnie zasada takich metod opiera się na schemacie: jeden bulion namnażający – jedna pożywka selektywno-różnicująca – jeden test potwierdzający. W związku z tym do realizacji alternatywnej ścieżki diagnostycznej potrzebny jest podobny rodzaj wyposażenia jak do hodowlanej metody znormalizowanej. Ponieważ jednak znacznemu zmniejszeniu ulega ilość inkubowanych płytek z pożywką selektywno-różnicującą i ilość testów potwierdzających, potrzebujemy mniej miejsca w cieplarkach o temperaturze 37±1°C. Ponadto należy jeszcze wziąć pod uwagę ewentualną potrzebę potwierdzeń wyników dodatnich zalecaną przez producenta. Dlatego wybierając metodę alternatywną należy przede wszystkim dokładnie zapoznać się z zaleceniami producenta odnośnie wymaganego wyposażenia. 

Metoda PCR w systemie zamkniętym lub otwartym

Skoro już jesteśmy przy metodach alternatywnych, szczególnie warto wyróżnić badania techniką PCR, która jest coraz chętniej stosowana w badaniu żywności. Ta technika także wymaga wstępnego namnożenia próbki, dlatego podobnie jak w wyżej opisanych metodach potrzebne będą m.in. wagi, dilutor, stomacher oraz przynajmniej jedna cieplarka ustawiona na 37°C (wspólna temperatura dla namnożenia i ewentualnego potwierdzenia); jednak są to sprzęty, które i tak mamy już w laboratorium badającym tradycyjnymi metodami. Dodatkowo potrzebne będą pipety automatyczne (zwykle 5–50 µl, 8-kanałowowa 5–50 µl, pipeta elektroniczna z funkcją dozowania 10–100 µl, fot.4) oraz zamykacz/otwieracz do testów.

Fot. 4. 8-kanałowa pipeta elektroniczna bardzo przyspiesza i ułatwia pracę w analizach PCR (Thermo Scientific™ Finnpipette™ Novus)

Oczywiście, musimy mieć termocykler, który jest sercem systemu (fot.5). Na co zwrócić uwagę przy wyborze systemu? Ważnym parametrem opisującym wydajność termocyklera jest jego maksymalna szybkość grzania bloku – najlepsze termocyklery bez problemu osiągają do 9,0°C/sekundę. Szybki blok grzewczy to krótszy cykl i więcej badań w ciągu jednej zmiany pracy laboratorium. Kolejnym istotnym parametrem są możliwe do wykorzystania barwniki, im jest ich więcej tym szersze portfolio testów takie urządzenie będzie potrafiło obsłużyć. Najlepsze obecnie stosowane rozwiązania zapewniają jednoczesny odczyt do 6 kanałów na próbkę, co umożliwia stosowanie testów typu multiplex, w których zachodzi równolegle wiele reakcji. Nowoczesne termocyklery to także możliwość pracy przez wifi czy łączność z danymi w chmurze. Termocyklery przeważnie umożliwiają przeprowadzenie do 96 reakcji w jednym cyklu pracy trwającym, w przypadku czołowych urządzeń, ok. 80 minut. Dużym udogodnieniem jest także możliwość jednoczesnego wykonywania analiz w kilku kierunkach, np. obok Listerii można równolegle wykrywać Salmonellę. Termocykler jest urządzeniem kompaktowym – zajmuje mniej więcej tyle miejsca, co dołączony do niego laptop. Pracą urządzenia steruje dedykowane oprogramowanie, które automatycznie ustawia parametry reakcji, a następnie analizuje wyniki. Są one w prosty sposób przedstawiane jako plus/minus.

Fot. 5. Termocykler Quant Studio 5 do oznaczania Listeria spp. techniką PCR (Thermo Scientific)

System otwarty tym różni się od zamkniętego, że wyposażony jest w dodatkowe oprogramowanie dla zaawansowanych użytkowników, które umożliwia wykonywanie badań w różnych kierunkach np. wykrywanie GMO czy oznaczanie gatunkowości, jednak w tym przypadku interpretacja wyników będzie leżała już po stronie użytkownika.

Dobre komercyjne zestawy testów dedykowanych dla Listeria zawierają wszystkie niezbędne odczynniki i materiały zużywalne (próbówki do PCR, korki optyczne). Przy pomocy odczynników do izolacji przygotujemy DNA poszukiwanego patogenu do dalszych badań. Etap ten jest krótki – trwa około 15 minut. Do jego wykonania potrzebny jest automatyczny blok grzewczy lub standardowe nastawne suche bloki grzewcze. Automatyczny blok grzewczy można zaprogramować tak, aby zgodnie z procedurą najpierw podgrzał próbki do 37°C przez 10 min, a następnie do 95°C przez 5 min. Na koniec próbki zostaną schłodzone w oczekiwaniu na dalszy etap badania. W przypadku wykorzystania standardowego bloku grzewczego niezbędna jest asysta użytkownika, który po odpowiednim czasie przeniesie próbki do kolejnej temperatury.

Wyizolowanym DNA uwadniamy następnie gotowe liofilizowane testy. Po załadowaniu ich do termocyklera nie pozostaje nic innego jak oczekiwać na wynik. Metoda PCR jest mało pracochłonna, jedyna która daje wyniki dla patogenów w 24 godziny. Obecnie systemy PCR zostały tak zaprojektowane, aby maksymalnie skrócić czas uzyskania wyników, zminimalizować ilość czynności manualnych wykonywanych przez operatora i ograniczyć ilość koniecznego wyposażenia.

Z racji niewielkich rozmiarów samych urządzeń, nawet powierzchniowo małe, przyzakładowe laboratoria mogą sobie pozwolić na wprowadzenie tego rozwiązania, jako rutynowy sposób badania próbek.

Ciekawym uzupełnieniem metody PCR, szczególnie dla klientów którzy wykonują duże ilości analiz, ale mają bardzo niewiele wyników dodatnich, jest system do automatycznego łączenia i zagęszczania wstępnie namnożonych próbek (fot.6). Przykładem może być system Pathatrix®. Urządzenie daje możliwość łączenia do 10 próbek w jedną próbkę analityczną, a tym samym redukuje koszty badań nawet o 90%. Dzięki opłaszczonym przeciwciałami kuleczkom magnetycznym można przeprowadzić izolację specyficznych bakterii spośród flory towarzyszącej oraz oczyścić próbkę z inhibitorów reakcji PCR.

Fot. 6. System do łączenia i zagęszczania wstępnie namnożonych próbek Pathatrix®

Podsumowanie

Jak widać, od decyzji co do rodzaju metody badawczej, którą będziemy badać swoje próbki, istotnie zależy rodzaj i ilość wyposażenia, w które musimy zaopatrzyć laboratorium. Warto więc na początkowym etapie rozważań nad kierunkiem rozwoju swojego laboratorium wziąć pod uwagę możliwości, jakie dają poszczególne metody badań, wielkość nakładów finansowych w stosunku do oczekiwanych efektów oraz perspektywy dalszego rozwoju laboratorium co do ilości i rodzaju badań.


 Artykuł jest częścią opracowania - FoodFakty NAWIGATOR - Listeria w przemyśle spożywczym


 

 

Wybierz obszar: Badania żywności Bezpieczeństwo żywności Mikrobiologia żywności

Autor: Argenta

Artykuł opublikowany dzięki firmie:

Zapisz się do newslettera

Najważniejsze informacje dla branży spożywczej!

Zapisz się na newsletter FoodFakty i bądź na bieżąco:

Zapisz się
Facebook Twitter LinkedIn