Rozcieńczanie seryjne to procedura obejmująca stopniowe rozcieńczanie substancji w celu uzyskania roztworów o różnych stężeniach. Technika ta polega przede wszystkim na systematycznym rozcieńczaniu stężonego roztworu, co czyni ją łatwiejszą w zastosowaniu i manipulowaniu stężeniem kultur komórkowych do dalszych analiz mikrobiologicznych. Seryjne rozcieńczenia stanowią niezastąpione narzędzie w badaniach mikrobiologicznych, wypełniając lukę pomiędzy wysokimi stężeniami a wymiernymi poziomami oraz zapewniając dokładność i powtarzalność badań laboratoryjnych. Należy jednak pamiętać, że staranność i rygor poświęcony kontroli jakości przygotowywanych podłoży są kluczowe, ponieważ niewłaściwe rozcieńczenia mogą prowadzić do zafałszowanych wyników.

Kontrola jakości przygotowywanych podłoży, dokumenty normatywne

Najczęściej stosowanymi podłożami w mikrobiologii żywności jest buforowana woda peptonowa (BPW), roztwór fizjologiczny z peptonem (MRD) czy sól fizjologiczna (NaCl). Przygotowanie rozcieńczeń mikrobiologicznych wymaga starannej kontroli jakości używanych podłoży. Elementy takie jak data ważności, stan fizyczny, chemiczny i mikrobiologiczny podłoży są kluczowe. Każde odstępstwo od normy może wpłynąć na wyniki badań, dlatego kontrola jakości stanowi fundament procesu. Gotowe pożywki do użycia posiadają certyfikat jakości, tj. potwierdzone wyniki badań kontrolnych danej serii. Natomiast w przypadku pożywek samodzielnie przygotowywanych przez laboratorium odpowiedzialność za zapewnienie odpowiedniej jakości spoczywa na laboratorium. 

Pomocnymi dokumentami, mówiącymi o zakresie i częstotliwości kontroli pożywek, mówią między innymi normy EN 12322, gdzie określa się kryteria oceny jakości pożywek do diagnostyki in vitro czy ISO/TS 11133, gdzie znajdziemy wytyczne dotyczące kontrolowania jakości pożywek mikrobiologicznych oraz przygotowywania i wytwarzania pożywek.

Parametry jakości pożywek mikrobiologicznych to zarówno właściwości ogólne, takie jak: pH, objętość rozlanej pożywki, przejrzystość, konsystencja czy zabarwienie; jak i właściwości mikrobiologiczne – sterylność czy cechy hodowlane zależne od składu chemicznego (specyficzność/selektywność). Jakość pożywek zależy m.in. od: składu ilościowego, jakości składników, procedury przygotowania, procesu sterylizacji, sposobu pakowania czy warunków przechowywania.

Ograniczenia techniki rozcieńczeń seryjnych

Rozcieńczanie seryjne, choć jest podstawową i szeroko stosowaną techniką w praktyce laboratoryjnej, wiąże się z pewnymi wyzwaniami. Technika ta ma nieodłączne ograniczenia, które mogą wpływać na dokładność i wiarygodność wyników:

• Niestandaryzowane objętości: przygotowując podłoże z bazy w proszku lub nalewając 9ml do probówek, jesteśmy narażeni na wahania napełnianych objętości. Według ISO 6887-1:2017 możliwe odchylenie powinno wynosić maksymalnie 2%. Niedokładności mogą prowadzić do niedokładnych pomiarów, szczególnie w wyższych rozcieńczeniach, co podważa wiarygodność wyników.
• Czasochłonne: Samodzielne przygotowywanie podłoży zajmuje bardzo dużo czasu – zarówno uwodnienie sproszkowanego podłoża, jak jego sterylizacja i późniejsza kontrola jakości.
• Zależność od jednorodnej dyspersji: Wiarygodność seryjnych rozcieńczeń zależy od równomiernego rozmieszczenia organizmów w każdym rozcieńczeniu. Niedoskonałości w pipetowaniu lub mieszaniu mogą prowadzić do niespójnych wyników. Zapewnienie spójnych wyników wymaga rygorystycznego szkolenia w zakresie technik pipetowania i dokładnego mieszania.
• Przechowywanie podłoży: gotowe do użycia podłoża zazwyczaj wymagają przechowywania w temperaturze lodówkowej oraz ich termin przydatności jest bardzo krótki.
• Urazy personelu: osoba wykonująca seryjne rozcieńczenia, poprzez wibracje vortex-u (mieszadła laboratoryjnego) absorbowanych przez nadgarstek, jest narażona na urazy dłoni lub nadgarstka. Ergonomiczne stanowiska pracy i odpowiednie narzędzia zapobiegają urazom zawodowym oraz zwiększają komfort pracy.
• Proces pracochłonny: Rozcieńczanie seryjne, ze względu na charakter ręczny, jest pracochłonne i podatne na błędy ludzkie. Doprowadziło to do stworzenia sprzętu do pół-automatycznego rozcieńczania, zwiększającego precyzję i ograniczającego wpływ człowieka.

Labrobot Dilucup - innowacyjne rozwiązanie

W kontekście przygotowywania rozcieńczeń, warto zwrócić uwagę na innowacyjne rozwiązanie firmy Labrobot – system Dilugent Shaker. To urządzenie, które znacząco usprawnia i przyspiesza proces przygotowywania rozcieńczeń mikrobiologicznych. Dzięki pół-automatycznemu systemowi rozcieńczania, Dilugent Shaker gwarantuje dokładność, precyzję i zminimalizowanie ryzyka ludzkiego błędu.

Główne zalety Dilucup System

- Najwyższa jakość: Standaryzacja rozcieńczeń oraz powtarzalne wytrząsanie; spójność receptury i procesu przygotowania; idealnie odmierzone objętości 9mL ± 2 % zgodnie z ISO 6887-1:2017, gwarancja sterylności potwierdzone Certyfikatami Jakości.

- Śledzenie procesu: zapisuje informacje o partii Dilucup®, identyfikatorze operatora, nazwie próbki, czasie wytrząsania, prędkości obrotowej, liczbie rozcieńczeń w próbce oraz dniu i godzinie rozcieńczenia. Łatwy eksport danych do pamięci USB oraz możliwe powiązanie z LIMS.

- Oszczędność czasu: Gotowe do użycia kubki do rozcieńczania (MRD/BPW/NaCl) pozwalają na oszczędność czasu o połowę w porównaniu ze standardowymi probówkami! Dodatkowo proces rozcieńczenia zajmuje połowę mniej czasu niż tradycyjna metoda rozcieńczeń mikrobiologicznych.

- Łatwy w użyciu: Dzięki intuicyjnej aplikacji Dilucup korzystanie z urządzenia jest proste i nie wymaga wcześniejszego szkolenia.

- Wspomaga ergonomię pracy laboranta: Nie ma potrzeby używania mieszadła typu vortex  – wszystkie wstrząsające wibracje są pochłaniane przez urządzenie, co zapobiega urazom nadgarstka spowodowanym przeciążeniem wielokrotnego używania vortexu.

- Łatwość przechowywania: Dilucup zajmuje o połowę mniej miejsca niż probówki! Nieotwarte opakowanie może być przechowywane do 30 miesięcy w temperaturze pokojowej, otwarte do 3 miesięcy w lodówce.

Podsumowując, choć seryjne rozcieńczenia są nieocenionym narzędziem w dziedzinie nauki, należy koniecznie zdać sobie sprawę z ich nieodłącznych ograniczeń. Sprostanie tym wyzwaniom i włączenie strategii łagodzących może zwiększyć niezawodność i precyzję tej techniki, zapewniając, że pozostanie ona solidną metodą w różnych zastosowaniach laboratoryjnych.

Przydatne linki:

Porównanie tradycyjnej metody do Dilugent Shaker 

Jak wyglądają seryjne rozcieńczenia z Dilugent Shaker? 

Śledzenie rozcieńczeń – koniec z błędami!  

Ergonomia pracy z Dilugent Shaker 

Bibliografia:

• ISO 17025:2017 - General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. International Organization for Standardization. (https://www.iso.org/standard/66912.html)
• ISO 7218:2007 - Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations. International Organization for Standardization. (https://www.iso.org/standard/37285.html)
• Eklund, T. (2000). Ergonomics in microbiological laboratories. Applied Ergonomics, 31(6), 609–613. (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003687000000842)
• Pratt, D. S., & Woodruff, H. B. (1995). Laboratory Quality Control: A Survey of Practices for Ensuring Accurate Microbiological Results. Applied and Environmental Microbiology, 61(8), 3438–3441. (https://aem.asm.org/content/61/8/3438)
• Hasman, H., Saputra, D., Mushtaq, S., & Voldby Larsen, M. (2014). Antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from broilers in a Scandinavian broiler production. Antimicrobial Resistance and Infection Control, 3(1), 17. (https://aricjournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/2047-2994-3-17)
• Labrobot - Dilucup. Oficjalna strona producenta. (https://www.labrobot.com/products/dilucup/)
• https://microbiologynote.com/pl/serial-dilution-method/
• Leiva, S., Gálvez, A., Martínez-Cañamero, M., & Huertas, J. L. (2015). Microbiological and Sensory Quality of Fruit Juices Treated by a Short Time High Intensity Pulsed Electric Field (Pef) at Various Ph Levels. Food and Bioprocess Technology, 8(4), 850-860. (https://link.springer.com/article/10.1007/s11947-014-1441-1)