Mikrobiologiczne zanieczyszczenia żywności są poważnym problem zarówno dla producentów, jak i konsumentów na całym świecie. Stanowią ono nie tylko spore ryzyko zdrowotne, ale co równie istotne, niosą za sobą negatywne skutki ekonomiczne i gospodarcze.

Jedną z najbardziej znanych przyczyn bakteryjnego zatrucia pokarmowego i związanych z nim stanów zapalnych żołądka i jelit jest z całą pewnością Salmonella. W związku z tym, z ponad 30 patogennych czynników, bakteria ta jest głównym powodem do niepokoju w przemyśle spożywczym, a kontrola jej występowania na każdym etapie procesu produkcyjnego ma zasadnicze znaczenie dla producentów żywności.

Badaniom czystości mikrobiologicznej poddawane są zarówno surowce, półprodukty, jak i produkty końcowe. Dodatkowo, obligatoryjne są także badania personelu oraz środowiska produkcyjnego (powietrze, pomieszczenia, urządzenia oraz wykorzystywane media takie, jak woda technologiczna, czy sprężone powietrze).

Z mikrobiologicznego punktu widzenia rodzaj Salmonella to Gram-ujemne, względnie beztlenowe pałeczki, należące do rodziny Enterobacteriaceae. Nie mają zdolności tworzenia zarodników, choć zazwyczaj zaopatrzone są w rzęski, dzięki którym możliwy jest ich ruch. W obrębie rodzaju wyróżnia się jedynie dwa gatunki: Salmonella enterica i Salmonella bongori, ale wśród nich ponad 2500 typów serologicznych, scharakteryzowanych na podstawie ich antygenów somatycznych (antygen O) i rzęskowych (antygen H).

Próbki z obszaru łańcucha żywnościowego badane są pod kątem wykrywania obecności i/lub oznaczania liczby Salmonella spp. W laboratoriach badanie najczęściej przeprowadza się metodą znormalizowaną, zgodną z PN-EN ISO 6579-1:2017-04 (Mikrobiologia łańcucha żywnościowego -- Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella - Część 1: Wykrywanie Salmonella spp), choć po spełnieniu określonych wymagań i poprawnej procedurze walidacyjnej istnieje możliwość przeprowadzenia badania metodami alternatywnymi, opartymi na technikach hodowlanych, testach biochemicznych i immunologicznych, ale także z wykorzystaniem narzędzi biologii molekularnej.

Ponieważ o skuteczności wykrywania bakterii Salmonella decyduje wiele parametrów takich, jak rodzaj i wielkość badanej próbki, źródło materiału do badań, rodzaj i skład zastosowanych pożywek, czas i temperatura hodowli selektywnej, czy też liczba kolonii pobranych do badania, to zastosowanie odpowiednio dobranej metody ma kluczowe znaczenie dla rzetelności otrzymanych wyników.

Systemowa Klasyka (ISO)

Płytkowa metoda hodowlana uznawana jest za referencyjny standard w diagnostyce patogenów żywnościowych. Umożliwia ona nie tylko identyfikację bakterii poprzez określenie ich właściwości morfologicznych i biochemicznych, ale dodatkowo stanowi źródło materiału do badań innymi metodami, m.in. do analiz molekularnych. Dla prawidłowego przeprowadzenia hodowli istotny jest dobór odpowiednich warunków środowiskowych oraz mediów hodowlanych tak, aby spełniały one wymagania patogenów obecnych w badanym materiale, zapewniając im optymalne warunki wzrostu. Wymagania te uwzględnia się w tworzeniu metodyki badawczej.

W przypadku bakterii Salmonella międzynarodową metodykę opisano w normie PN-EN ISO 6579-1:2017-04 (Mikrobiologia łańcucha żywnościowego -- Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella - Część 1: Wykrywanie Salmonella spp). Normatywna metodyka opiera się na zastosowaniu szeregu podłoży, przesiewów i reakcji potwierdzających, ale dzięki jej zastosowaniu wykryta może zostać większość serotypów tego drobnoustroju.

W szybkości siła

Mnogość przesiewów i hodowli, dodatkowych etapów identyfikacji – od morfologicznych, przez biochemiczne, po serologiczne powoduje, że tradycyjna diagnostyka laboratoryjna próbek w kierunku Salmonella spp. jest bardzo praco- i czasochłonna. W związku z powyższym coraz częściej ustępuje ona miejsca alternatywnym metodom pozwalającym na szybkie wykrywanie patogenów.

Zgodnie z Rozporządzeniem Komisji (WE) 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych (z późniejszymi zmianami), laboratoria i przedsiębiorstwa przemysłu spożywczego mają możliwość wykorzystywania alternatywnych metod analitycznych, w tym szczególnie tzw. szybkich metod, o ile ich wykorzystanie daje równoważne wyniki udowodnione procedurą walidacji. Ze względu na ich prostotę oraz dzięki zastosowaniu innowacyjnych bulionów namnażających i selektywno-różnicujących mediów hodowlanych, a ponadto różnych wariantów etapu potwierdzeń, wynik ujemny uzyskuje się już po 48 godzinach.

Dostępne są różnego rodzaju gotowe zestawy z podłożami naniesionymi na paski, bądź płytki z tworzywa, na które aplikuje się rozcieńczoną próbkę i inkubuje w określonych warunkach.

W celu spełniania wymagań i potrzeb związanych z rutynowymi badaniami wybierać możemy także spośród szerokiego spektrum wysokiej jakości podłoży chromogennych. W mediach tych zastosowano specyficzne barwne substraty oraz wskaźniki redoks, które ulegając hydrolizie pod wpływem wytwarzanych przez bakterie enzymów, przekształcane są do barwnych produktów, co zapewnia skrócenie czasu badania, łatwy odczyt oraz wiarygodne wyniki. Dodatkowo, w skład podłoża często wchodzi nie jeden, a kilka chromogennych substratów, co umożliwia rozróżnienie na jednym podłożu kilku rodzajów/gatunków bakterii jednocześnie.

Na rynku dostępne są również gotowe zestawy składające się z łopatki pokrytej po obu stronach jedną, dwoma lub trzema pożywkami agarowymi, selektywnymi wobec oznaczanego drobnoustroju.

Papierowa innowacja

Popyt na analizy mikrobiologiczne wciąż rośnie, a jednocześnie, przy ograniczonej ilości miejsca w laboratorium, trudno „rozciągnąć” infrastrukturę badawczą. W obliczu zwiększającej się liczby prób, odpowiedzią może okazać się innowacyjny system „papierowych” płytek. Płytki są gotowe do bezpośredniego użycia, zajmują mało miejsca i można je przechowywać przez długi czas. Składają się z papierowej podstawy pokrytej warstwą polietylenu, podzielonej na centymetrowe kwadraty, co znacznie ułatwia późniejsze liczenie kolonii bakteryjnych. Na podstawę naniesiona jest selekcyjna pożywka hodowlana, a całość przykryta jest przezroczystą folią polipropylenową zawierającą warstwę czynnika żelującego oraz barwnego wskaźnika. Dzięki obecności indykatora kolonie bakteryjne barwią się na kolor czerwony, co znacznie ułatwia ich liczenie. Co szczególnie istotne, w porównaniu z metodą standardową pracochłonność i szybkość tej techniki jest dwukrotnie mniejsza, przy zbliżonym koszcie wykonania analiz.

Biochemia bez tajemnic

Dostępne testy biochemiczne pozwalające na wykrywanie pałeczek Salmonella opierają się na ocenie zdolności tych mikroorganizmów lub jej braku do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych. Są to gotowe zestawy pożywek umieszczonych na paskach, pałeczkach lub mikropłytkach, z ewentualnym dodatkiem barwnego wskaźnika.

Do testów biochemicznych zaliczamy również testy enzymatyczne, składające się z syntetycznych substratów, które w obecności enzymów charakterystycznych dla Salmonella i po dodaniu czynnika wywołującego zmianę koloru, ujawniają barwną reakcję chemiczną.

Immuno-odpowiedź

Metody immunologiczne opierają się na specyficznej reakcji antygen – przeciwciało. Dla łatwiejszej i pewniejszej interpretacji wyników często wykorzystuje się antygeny lub przeciwciała znakowane enzymami, fluorochromami lub radioizotopami.

Szeroką gamę testów immunologicznych stanowią testy aglutynacyjne, w których przeciwciała umieszczone na barwnych cząsteczkach lateksu, reagując z wprowadzonym specyficznym antygenem, wywołują reakcję immunologiczną pociągającą za sobą wtórną aglutynację, spowodowaną agregacją opłaszczonych cząstek lateksu.

W tej grupie metod dużą popularnością cieszy się także immunoenzymatyczna technika ELISA (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) wraz z jej wariantem – testem kanapkowym. W teście tym przeciwciało specyficzne dla danego antygenu związane jest z fazą stałą. Antygen wprowadzany z badaną próbką zostaje związany z przeciwciałem i tym samym unieruchomiony na nośniku. Po wymyciu niezwiązanych antygenów, wprowadza się porcję specyficznych przeciwciał znakowanych enzymem, a dodanie odpowiedniego substratu wywołuje reakcję barwną.

Omawiając immunologiczne metody wykrywania Salmonelli nie sposób nie wspomnieć o najnowszej technice enzymoimmunofluorescencyjnej (ang. ELFA) wykorzystującej rekombinowane białko faga. W metodzie tej wszystkie etapy badań, od pobrania próbki do wydania wyników, wykonywane są automatycznie. Gotowe zestawy testów oraz maksymalna redukcja czynności manualnych zapewniają uzyskanie rzetelnych wyników w czasie krótszym niż 19 godzin oraz stałe monitorowanie procesu.

Jeden protokół, wiele możliwości

Ponieważ pałeczki Salmonella to nie jedyne patogeny, których oznaczanie w żywności jest obligatoryjne, dlatego wszystkie systemy, które multiplikują możliwości analityczne są chętnie wykorzystywane w laboratoriach badawczych. Warto tu wymienić system diagnostyki molekularnej wykorzystujący metodę izotermalnej amplifikacji DNA oraz bioluminescencyjnej detekcji. Jego zastosowanie oszczędza nie tylko czas, ale także obniża koszty pracy dzięki gotowym do użycia odczynnikom, jednemu protokołowi dla różnych patogenów i wynikom otrzymywanym tego samego lub następnego dnia.

Po nici do kłębka

Gwałtowny rozwój biologii molekularnej otworzył nowe możliwości także w diagnostyce bakterii Salmonella. Do ich wykrywania wykorzystuje się łańcuchową reakcję polimerazową (PCR), w tym także tą w czasie rzeczywistym (Real Time PCR). Metoda polega na powielaniu in vitro poszukiwanego fragmentu kwasu nukleinowego z użyciem specyficznych primerów oraz termostabilnych enzymów. Etap izolacji DNA wykonywany jest manualnie lub automatycznie, natomiast detekcja produktów amplifikacji oraz analiza uzyskanych danych odbywa się w sposób w pełni zautomatyzowany. Przy otwartych systemach do izolacji DNA istnieje możliwość wykorzystania zestawów do magnetycznej separacji, jednak główną zaletą automatycznych systemów zamkniętych jest otrzymywanie wysokiej jakości oczyszczonych próbek wyizolowanego DNA przy minimalnym nakładzie pracy. Po etapie izolacji DNA, amplifikacja oraz detekcja zachodzą w termocyklerze w ciągu kilkudziesięciu minut. Całkowity czas wykonania oznaczenia, razem z przednamnożeniem próbki, wynosi zatem od 18 do 24 godzin. Metoda PCR jest ponadto specyficzna i umożliwia odróżnienie laboratoryjnych szczepów na podstawie nawet niewielkich różnic w sekwencji ich materiału genetycznego.

Ponieważ wszystkie wymienione wyżej metody pozwalają na stworzenie efektywnego systemu wykrywania Salmonelli oraz monitorowania jakości w branży spożywczej, a każda z nich ma swoje wady i zalety, to wybór tej właściwej leży w gestii danego laboratorium badawczego.

Literatura:

1. Paniel N., Noguer T.: Detection of Salmonella in Food Matrices, from Conventional Methods to Recent Aptamer-Sensing Technologies. Foods, 2019, 8 (9), 371.
2. Salmonella Detection and Identification Methods for Food Processors. Guide to Food Microbiology Testing. Traditional and Alternative Methods, 2019.
3. Mikołajczyk A., Stefaniuk E., Bosacka K., Hryniewicz W.: Właściwości i zastosowanie podłoży bakteriologicznych. Post. Mikrobiol., 2016, 55 (3), 320- 329.
4. Eng SK., Pusparajah P., Ab Mutalib NS., Ser HL., Chan KG., Lee LH.: Salmonella: A review on pathogenesis, epidemiology and antibiotic resistance. Frontiers in Life Science, 2015, 8 (3), 284- 293.
5. Dera-Tomaszewska B.: Metody typowania bakterii Salmonella. Medycyna Wet., 2011, 67 (3), 162- 167.
6. PN-EN ISO 6579-1:2017-04 Mikrobiologia łańcucha żywnościowego -- Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella - Część 1: Wykrywanie Salmonella spp) https://sklep.pkn.pl/pn-en-iso-6579-1-2017-04p.html
7. ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych.

TO I WIĘCEJ OPRACOWAŃ NA TEMAT SALMONELLI POBIERZ DARMOWY NAWIGATOR:

UWAGA - GWARANCJA FOODFAKTY Foodfakty nie pobierają i nie będą pobierać żadnych opłat za pobranie materiałów ogólnie dostępnych dla czytelników na portalu oraz za rejestrację konta czytelnika. Jeśli materiały są możliwe do pobrania przez zalogowanego czytelnika lub poprzez kwestionariusz to na pewno nie łaczą się z tym żadne opłaty ani przyszłe zobowiązania. Jeśli materiały są odpłatne, to są jednoznacznie oznaczone oraz podana jest cena, a udostępnienie materiału następuje wyłacznie po wcześniejszej zapłacie, kóra jest potwierdzeniem zlecenia.