Według danych PZH w Polsce od wielu lat salmonelozy są najczęściej odnotowywanymi zatruciami o etiologii bakteryjnej. Baza EPIMELD raportuje 8928 przypadków w 2019 roku, natomiast do 30 kwietnia 2020 odnotowano 854 salmoneloz. Salmonella sp. to bakterie należące do rodziny Enterobacteriaceae. Ich wzrost obserwowany jest pomiędzy 5 a 50°C, przy pH oscylującym w zakresie od 4,5 do 9,0. Minimalna aktywność wody, przy której obserwowany jest wzrost pałeczek z rodzaju Salmonella wynosi 0,97.

Patogen ten odznacza się wyjątkową opornością na wysuszenie. Bakterie te przez lata mogą przeżywać w glebie, wodzie, kurzu, ale również w żywności o obniżonej aktywności wody. Dla przykładu Kotzekidou (1998) wykazał, że Salmonella Enteritidis przeżywa 8 miesięcy w chałwie o aktywności wody 0,18. Jedną z grup produktów spożywczych, w których stosunkowo często odnotowywana jest obecność patogennych pałeczek z rodzaju Salmonella są zioła i przyprawy. Przegląd systemu RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) wskazuje, że rocznie odnotowywane jest kilkadziesiąt przypadków obecności Salmonella sp. w przyprawach. W ostatnich latach znacząco wzrasta odsetek powiadomień dotyczących odrzuceń na granicy (rys. 1). Przyprawy, których najczęściej dotyczą powiadomienia alarmowe to imbir (8 zgłoszeń), kminek (7 zgłoszeń) oraz kurkuma, pieprz czarny i papryka sproszkowana (po 5 zgłoszeń). Wśród przypraw, które zostały odrzucone podczas kontroli granicznej zdecydowanie dominuje pochodzący z Brazylii czarny pieprz. Przyprawy tej dotyczyło aż 87 zgłoszeń o odrzuceniu granicznym (72,5%).

Rys. 1. Zgłoszenia przypraw do systemu RASFF

Obowiązujące na terenie Unii Europejskiej Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych, wraz z późniejszymi zmianami, nie określa żadnych wymagań dla tej grupy produktów spożywczych. Należy jednak pamiętać o tym, że odpowiedzialność za bezpieczeństwo żywności ciąży na przedsiębiorcy, który ją produkuje, transportuje, przechowuje lub sprzedaje. Nie zwalnia to zatem od samodzielnego stworzenia kryteriów mikrobiologicznych. Analiza ryzyka wskazuje, że jednym z wymagań, które powinny zostać uwzględnione, zarówno przez producentów przypraw, jak i przez przedsiębiorstwa gdzie są one surowcem, powinna być nieobecność Salmonella w 25 g. Jednocześnie matryca ta uznawana jest za jedną z trudniejszych w analityce mikrobiologicznej, a dane literaturowe wskazują na częste uzyskiwanie wyników fałszywie ujemnych.

Pobór próbki a wynik badania

Pobór próbki to pierwszy i bardzo ważny moment w całej procedurze analitycznej. Bardzo często to właśnie od tego etapu zależy powodzenie analityka. Zastosowana metodologia powinna być ściśle skorelowana z rodzajem matrycy żywności. Pierwszą z przyczyn, która może prowadzić do uzyskania niewłaściwego wyniku badań jest punktowy rozkład zanieczyszczeń mikrobiologicznych w matrycy stałej. Aby uniknąć błędu związanego z poborem próbek zaleca się wieloetapowość próbkowania obejmującą: wytypowanie partii, pobranie próbek pierwotnych, połączenie próbek pierwotnych w zbiorczą i dopiero w efekcie końcowym wydzielenie próbek laboratoryjnych, a z nich analitycznych. W przypadku badań prowadzonych w kierunku oznaczania Salmonella w ziołach i przyprawach masa próbki analitycznej wynosi 25 g. Kluczowe znaczenie w przypadku omawianej matrycy ma zastosowana metoda poboru próbek pierwotnych. Najbardziej korzystne jest stosowanie metod statystycznych czyli próbkowania losowego lub systematycznego. Jeśli w produkcie, który poddajemy ocenie możliwy jest punktowy wzrost mikroorganizmów zadawalające efekty przynieść może próbkowanie wielostopniowe. W tym przypadku w pierwszym etapie należy pobrać dużą liczbę próbek pierwotnych stosując próbkowanie statystyczne. Spośród próbek tych wybierane są metodą losową kolejne, które służą do stworzenia próbki zbiorczej. W przedmiotowych aktach prawnych brak jest zapisów określających wielkość próbki laboratoryjnej. Praktyka laboratoryjna wskazuje, że powinna ona być co najmniej pięciokrotnie większa od analitycznej, aby umożliwić właściwe jej przygotowanie, jak również archiwizację do momentu uzyskania wyników badań. Analiza może być przeprowadzona z zastosowaniem najnowocześniejszych metod, ale nawet najlepsza metodologia będzie bezużyteczna, jeżeli próbka nie będzie odzwierciedlała rzeczywistego stanu partii produktu. Wiarygodna informacja może być dostarczona wyłącznie w przypadku, gdy próbka zostanie właściwie pobrana oraz prawidłowo przygotowana. Jednocześnie nie można zapominać o tym, że błąd poboru próbki jest bardzo trudny do oszacowania, gdyż zawsze wiąże się z błędem metody analitycznej.

Metody analityczne

Referencyjna metoda określania obecności Salmonella w żywności (PN–EN ISO 6579-1:2017-04) przewiduje cztery etapy analizy. Pierwszy etap to przednamnażanie w zbuforowanej wodzie peptonowej, kolejny obejmuje namnażanie selektywne w bulionie RVS oraz równolegle w pożywce MKTTn. Namnożone hodowle przesiewa się na odpowiednie pożywki selektywne. Pierwszą z nich jest pożywka agarowa XLD, natomiast drugą może być BGA, Hektoen Agar, Bizmuth Sulfite Agar wg Wilson Blaira czy jedna z wielu dostępnych na rynku pożywek chromogennych. Ostatni etap badania obejmuje potwierdzenie przynależności wyizolowanych z próbki żywności bakterii do rodzaju Salmonella. Opisana procedura jest praco- i czasochłonna. Pełny czas analizy może wynosić nawet 14 dni. Z tego względu możliwe jest stosowanie szybszych metod alternatywnych pod warunkiem ich zwalidowania w stosunku do metody referencyjnej. Najczęściej stosowane są metody immunoenzymatyczne, wykrywanie fagowe i metody biologii molekularnej. Metody alternatywne odznaczają się wysoką czułością i specyficznością, a ponadto pozwalają na znaczne skrócenie czasu analizy, redukują liczbę manipulacji i przesiewów dzięki automatyzacji, dlatego też znajdują coraz częstsze zastosowanie w analizie mikrobiologicznej żywności. W tabeli 1 porównano czas analizy w kierunku Salmonella metody referencyjnej oraz najczęściej stosownych metod alternatywnych.

Tabela 1. Porównanie metod wykrywania Salmonella sp.

Każda z wymienionych w tabeli 1 metod może być rekomendowana do wykrywania Salmonella sp. w przyprawach. Należy jednak pamiętać o tym, że składniki zawarte w tych surowcach, np. aldehyd cynamonowy i eugenol w cynamonie, tymol i karwakrol w oregano, alicyna w czosnku i cebuli mogą hamować wzrost Salmonella podczas namnażania nieselektywnego, czego efektem mogą być wyniki fałszywie ujemne, niezależnie od zastosowanej metody detekcji. Dlatego też kluczowym etapem decydującym o wiarygodności oznaczania obecności Salmonella w przyprawach jest etap nieselektywnego namnażania.

W metodzie zgodnej z PN-ISO 6579-1:2017 w celu wykrycia bakterii Salmonella w 25 g próbki stosowana jest zbuforowana woda peptonowa w ilości 225 ml, co daje rozcieńczenie 10-krotne. W tym przypadku stężenie substancji hamujących jest na tyle wysokie, że namnażanie nieselektywne może być nieskuteczne i mimo obecności Salmonella wynik będzie ujemny. Ponadto niektóre przyprawy, takie jak cebula zakwaszają medium namnażające, dlatego też przed inkubacją reguluje się pH do wartości ok. 6,8 lub stosuje się podwójnie stężoną zbuforowaną wodę peptonową. W celu neutralizacji substancji hamujących najczęściej w laboratoriach stosuje się wyższe rozcieńczenie próbki, ale jest to materiałochłonne i czasochłonne, ponadto zmniejsza czułość metody wykrywania Salmonella. Dlatego poszukiwane są chemiczne neutralizatory substancji antybakteryjnych w tej matrycy.

W procedurze zawartej w FDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 5 Salmonella (2007) do matrycy przypraw stosowany jest nieselektywny bulion TSB oraz modyfikacje metody przeznaczone do poszczególnych grup przypraw niwelujące hamujący wpływ składników matrycy:

• czarny i biały pieprz, nasiona lub płatki selera, chili w proszku, kminek, papryka, płatki pietruszki, rozmaryn, nasiona sezamu, tymianek i płatki warzywne

25 g próbki w 225 ml TSB (1:9), 60 minut w temperaturze pokojowej, regulacja pH do 6,8±0,2, inkubacja 24±2h w 35^oC

• płatki cebuli, cebula w proszku, płatki czosnku

25 g próbki w 225 ml TSB z dodatkiem 0,5% K₂SO₃ (1:9), 60 minut w temperaturze pokojowej, regulacja pH do 6,8±0,2, inkubacja 24±2h w 35^oC

• ziele angielskie, cynamon, goździki i oregano

dla tych czterech przypraw w tej chwili nie są znane metody neutralizacji ich toksyczności. Stosuje się wyższy współczynnik rozcieńczania 100-krotny dla cynamonu, ziela angielskiego i oregano oraz 1000-krotny dla goździków.

W tabeli 2 przedstawiono porównanie skuteczności metody oznaczania Salmonella w kontaminowanym cynamonie, gdzie zastosowano kombinację większego rozcieńczenia próbki 20-krotne oraz dodatku 0,5% K₂SO₃ do zbuforowanej wody peptonowej z metodą klasyczną (zbuforowana woda peptonowa, rozcieńczenie 10-krotne). Niezależnie od metody detekcji po namnażaniu zgodnym z PN-ISO6579-1:2017 dla wszystkich próbek kontaminowanych Lins (2018) uzyskał wyniki fałszywie ujemne. Zastosowanie modyfikacji etapu przednamnażania znacznie wpłynęło na skuteczność analizy. Udział wyników prawidłowych zależny był od poziomu kontaminacji matrycy i wynosił przy 50 jtk/25 g 86% i 85% odpowiednio dla metody hodowlanej i metody genetycznej (PCR/LAMP). Przy wyższym poziomie kontaminacji bakteriami Salmonella wszystkie próbki oznaczono jako dodatnie.

Tabela 2. Wpływ metody namnażania nieselektywnego i oznaczania na wynik analizy

Opracowanie na podstawie Lins (2018)

Innym sposobem neutralizacji związków hamujących wzrost drobnoustrojów jest dodatek aminokwasów. Fujisawa i wsp. (2009) stwierdzili, że jednym ze sposobów niwelowania hamującego działania alicyny zawartej w cebuli i czosnku jest dodatek cysteiny. Seryna zaś była stosowana podczas oznaczania Salmonella w cynamonie w celu neutralizacji aldehydu cynamonowego. Badania prowadzone przez Barrere i wsp. (2020) dotyczyły optymalizacji oznaczania Salmonella w czosnku, cebuli, cynamonie, chili i zielonej herbacie z zastosowaniem metody Real Time PCR. W przypadku czosnku i cebuli autorzy zastosowali zbuforowaną wodę peptonową, standardową i podwójnie stężoną z dodatkiem 30 mmol/l L-cysteiny i rozcieńczeniem próbki w medium namnażającego w stosunku1:9. Dla cynamonu medium namnażającym była podwójnie stężona zbuforowana woda peptonowa z dodatkiem 11,23 mmol/l DL-seryny i rozcieńczeniem próbki w medium namnażającego 1:9, 1:20. Odniesieniem były analogiczne procedury, ale bez dodatków neutralizujących substancje hamujące. Uzyskane przez autorów wyniki zebrano w tabeli 3.

Tabela 3. Skuteczność neutralizacji podczas oznaczania Salmonella w czosnku i cynamonie

Opracowanie na podstawie Barrere i wsp. (2020)

W przypadku czosnku i cebuli pozytywny efekt przyniosło zastosowanie dodatku L-cysteiny na etapie przednamnażania. Aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych w przypadku cynamonu należy zaś zastosować 100-krotne rozcieńczenie na etapie przednamnażania bądź 30-40-krotne łącznie z dodatkiem jako neutralizatora DL-seryny.

Laboratoria prowadzące badania mikrobiologiczne przypraw powinny również pamiętać, aby zweryfikować/zwalidować metodę. Zakres walidacji wymagany do rozszerzenia metody na nową matrycę zależy od tego, jak ściśle nowa matryca jest powiązana z tymi, które zostały uwzględnione w początkowej walidacji. Zgodnie z wytycznymi AOAC International jeśli nowy produkt, który zaczynamy badać należy do tej samej klasy wystarczy metodę zweryfikować, natomiast jeżeli zaczynamy badać produkt z innej klasy należącej do tej samej kategorii należy przeprowadzić pełną walidację metody. Przyprawy zostały podzielone na sześć klas (tabela 4).

Tabela 4. Podział przypraw na klasy wg wytycznych AOAC International

Podsumowanie

Przyprawy są grupą produktową, w której istnieje duże ryzyko obecności chorobotwórczych pałeczek z rodzaju Salmonella. Jednocześnie ich wykrywanie w tej matrycy obarczone jest dużym ryzykiem popełnienia błędu w postaci uzyskania wyniku fałszywie ujemnego. Aby je zminimalizować należy przede wszystkim opracować procedurę pobierania próbek do badań oraz właściwą metodę przednamnażania pozwalającą na neutralizację związków hamujących wzrost drobnoustrojów. Bardzo ważne jest również, aby rozszerając badania na nowe produkty zweryfikować/zwalidować stosowaną metodę.

Literatura:

1. AOAC Final Report and Executive Summaries from the AOAC International Presidential Task Force on Best Practices in Microbiological Methodology. 2006 AOAC International, Rockville.
2. Barrere, V.; Tompkins, E.; Armstrong, M.; Bird, P.; Bastin, B.; Goodridge, L. Optimization of Salmonella detection in garlic, onion, cinnamon, red chili pepper powders and green tea. Int. J. Food Microbiol. 2020, 316, 108440.
3. Fujisawa, H.; Watanabe, K.; Suma, K.; Origuchi, K.; Matsufuji, H.; Seki, T.; Ariga, T. Antibacterial Potential of Garlic-Derived Allicin and Its Cancellation by Sulfhydryl Compounds. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009, 73, 1948–1955.
4. Jonenburger, Ida.; Reij M.; Boer E.; Gorris L.; Zwietering M. Random or Systematic sampling to detect a localised microbial contamination within a batch of food. Food Control 2011, 22, 1448-1455.
5. Kotzekidou, P. Microbial stability and fate of Salmonella enteritidis in halva, a low-moisture confection. J Food Prot. 1998, 61(2), 181-5.
6. Lins, P. Detection of Salmonella spp. in spices and herbs. Food Control 2018, 83, 61–68.
7. Nowak, A. Pobieranie i przygotowanie próbek żywności. Przem. Spoż. 2018, 2, 26-29.
8. PN-EN ISO 6579-1:2017-04 - Mikrobiologia łańcucha żywnościowego - Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella - Część 1: Wykrywanie Salmonella spp.
9. Szkoda, J. Diagnozowanie jakości partii wyrobów metodą statystycznej kontroli odbiorczej z oceną alternatywną. Diagnostyka 2003, 26, 26-31.

TO I WIĘCEJ OPRACOWAŃ NA TEMAT SALMONELLI POBIERZ DARMOWY NAWIGATOR:

UWAGA - GWARANCJA FOODFAKTY Foodfakty nie pobierają i nie będą pobierać żadnych opłat za pobranie materiałów ogólnie dostępnych dla czytelników na portalu oraz za rejestrację konta czytelnika. Jeśli materiały są możliwe do pobrania przez zalogowanego czytelnika lub poprzez kwestionariusz to na pewno nie łaczą się z tym żadne opłaty ani przyszłe zobowiązania. Jeśli materiały są odpłatne, to są jednoznacznie oznaczone oraz podana jest cena, a udostępnienie materiału następuje wyłacznie po wcześniejszej zapłacie, kóra jest potwierdzeniem zlecenia.