Konwencjonalne testy na obecność bakterii grupy coli i E. coli, wykorzystujące metodę filtracji membranowej i wzrost w obecności substratów chromogennych, są czasochłonne gdyż wymagają potwierdzenia. Wobec tego poszukiwane są nowe metody dające jednoznaczne wyniki w wykrywaniu i identyfikacji tych bakterii. Ta strategia badawcza została zastosowana w komercyjnym teście Colilert, pozwalającym na jednoczesne badanie ilościowe liczby bakterii grupy coli i E. coli w wodzie bez potrzeby przeprowadzania badań potwierdzających.

Wprowadzenie

Bakterie Escherichia coli należą do tzw. grupy coli, która z kolei przynależy do rodziny Enterobacteriaceae. Bakterie te są charakteryzowane jako względnie beztlenowe, gramujemne pałeczki, nie tworzące przetrwalników. Pałeczki E. coli naturalnie występują w dolnym odcinku przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt ciepłokrwistych. W kale u ludzi i zwierząt E. coli występują w koncentracji około 10⁹/gram i stanowią około 1% całkowitej biomasy w jelicie grubym. W przeciwieństwie do innych bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, E. coli zwykle nie występuje naturalnie w środowisku roślinnym, glebie lub wodzie. Chociaż E. coli są częścią naturalnej mikrobioty kału, niektóre szczepy tych bakterii mogą powodować choroby żołądkowo-jelitowe oraz inne poważne problemy zdrowotne.

Pałeczki E. coli są bardzo wrażliwe na stres środowiskowy. Ich czas przeżycia w wodzie zależy od wielu czynników, w tym temperatury, ekspozycji na światło słoneczne, obecności innych mikroorganizmów oraz rodzaju wody (wody gruntowe, powierzchniowe lub wody uzdatnione). Bakterie przeżywają około 4–12 tygodni w temperaturze 15–18 °C w wodzie średnio zanieczyszczonej. Brak zdolności wzrostu E. coli do namnażania w wodzie, w połączeniu z krótkim czasem przeżycia w tym środowisku oznacza, że wykrywanie bakterii E. coli w wodzie i systemach wodnych jest dobrym wskaźnikiem dla wykrywania stosunkowo niedawnego zanieczyszczenia wody ściekami.

Choć nowoczesne techniki mikrobiologiczne umożliwiają wykrycie szerokiego spektrum bakterii chorobotwórczych, wirusów i pierwotniaków, w rutynowych badaniach wody wykrywa się tylko kilka rodzajów/gatunków bakterii. Powodem są głównie wysokie koszty związane z rutynowym oznaczaniem wszystkich patogenów oraz bardzo długi czas takiej analizy. Zamiast tego w analizie sanitarnej wody stosuje się określone wskaźniki mikrobiologiczne, których wykrywanie jest tańsze i mniej czasochłonne. Proste, niedrogie techniki oparte na metodach hodowlanych i/lub enzymatycznych umożliwiają testowanie większej liczby próbek, co daje dokładniejszy obraz jakości badanej wody. Nowsze metody molekularne mogą zapewnić łatwą i szybką metodę wykrywania patogenów lub wskaźników, jednak do tej pory stosowanie testów molekularnych w rutynowej analizie wody nie jest jeszcze stosowane.

Odpowiednie wskaźniki sanitarne stosowane w analizie wody: bakterie grupy coli i E. coli, paciorkowce kałowe oraz laseczki Clostridium perfringens wykazują kilka idealnych cech: pochodzenie jelitowe, występowanie w stosunkowo dużej liczbie w wodzie zanieczyszczonej ściekami, brak namnażania w wodzie oraz stosunkowo łatwa wykrywalność za pomocą prostych i niedrogich metod analitycznych.

Zanieczyszczenia mikrobiologiczne pochodzenia jelitowego stanowią największe zagrożenie dla zdrowia publicznego. Już w XIX wieku bakterie E. coli uznano za dobry wskaźnik zanieczyszczenia fekalnego. Zostały one zidentyfikowane jako jedyny gatunek w grupie coli występujący wyłącznie w przewodzie pokarmowym ludzi i innych zwierząt ciepłokrwistych, a następnie wydalany w dużych ilościach z kałem. Poza tym E. coli nie rozmnażają się w środowisku wodnym i mają żywotność tego samego rzędu co patogeny jelitowe. Cechy te umożliwiają wykrycie bakterii E. coli nawet przy znacznym rozcieńczeniu ścieków.

Obecnie coraz większą uwagę zwraca się na wirusy i pierwotniaki w systemach wodnych. Chociaż E. coli jest dobrym wskaźnikiem wegetatywnych form patogenów bakteryjnych, takich jak Salmonella czy Campylobacter, okazało się, że jest ona mniej efektywnym wskaźnikiem obecności w wodzie wirusów i pierwotniaków. W porównaniu z pierwotniakami i niektórymi wirusami, bakterie E. coli i pozostałe pałeczki grupy coli wykazują ograniczoną przeżywalność w wodzie i są bardziej podatne na wiele środków dezynfekujących powszechnie stosowanych w technologii wody wodociągowej. Przeżywalność wirusów w środowisku wodnym jest bardzo zróżnicowana. Chociaż mogą one z natury przetrwać dłużej niż bakterie, mogą mieć także i znacznie krótszą żywotność. Wynika to z faktu, że są to formy znacznie mniejsze od komórek bakteryjnych i pozbawione mechanizmów obronnych, dzięki czemu ulegają łatwiej fagocytozie przez inną mikroflorę obecną w wodzie. Badania wykazały również, że bakterie grupy coli w określonych warunkach mogą być wykorzystane do pośredniego wnioskowania o obecności patogennych pierwotniaków. Zatem obowiązek wykrywania określonych wirusów lub pierwotniaków w rutynowej analizie wody wydaje się tylko kwestią czasu.

Jakość mikrobiologiczna wody pitnej

Wykrywanie bakterii należących do grupy coli i E. coli jest istotnym elementem monitorowania jakości mikrobiologicznej wody pitnej. Starsze metody wykrywania bakterii grupy coli i E. coli, wykorzystujące np. bulion laurylotryptozowy lub agar Endo nie pozwalały na odróżnienie kolonii E. coli od innych rodzajów/gatunków bakterii z grupy coli (rys. 1).

Rys. 1. Wzrost bakterii grupy coli na podłożu Endo

Dlatego wymagane były liczne testy potwierdzające. Na przykład klasyczny test „IMViC” wykorzystywał proste reakcje biochemiczne do różnicowania bakterii w obrębie grupy coli. Do przeprowadzenia testów potrzebne były jednak dodatkowe pożywki i odczynniki, co czyniło procedury długimi i kosztownymi.

Już w latach 90-tych XX wieku badania pozwoliły na wskazanie dwóch enzymów charakterystycznych dla odpowiednio bakterii grupy coli i E. coli: beta-galaktozydazy oraz beta-glukuronidazy Później opracowano tzw. technologie zdefiniowanych substratów stosowanych w pożywkach lub testach pozwalające na jednoczesne i bardzo precyzyjne wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakterii grupy coli i E. coli. Technologia zdefiniowanych substratów opiera się na zasadzie, że tylko docelowy drobnoustrój, w tym przypadku E. coli, może wykorzystywać niezbędne składniki odżywcze z określonej pożywki. Różne metody oparte na wykrywaniu specyficznych enzymów zostały zatwierdzone przez amerykańską U.S. EPA, francuską AFNOR, czy też Polski Komitet Normalizacyjny. Opracowano metody enzymatyczne do równoczesnego zliczania i różnicowania bakterii z grupy coli oraz E. coli. Wszystkie analizy na obecność E. coli powinny być prowadzone zgodnie z zaleceniami właściwego organu. W wielu przypadkach zaleca się badanie wody wyłącznie w akredytowanych laboratoriach, które nie tylko przeprowadzą analizę, ale także pobiorą próbki do badań. Wszelkie stosowane zestawy testowe powinny spełniać minimalne wymagania dotyczące dokładności i wykrywania (czułości), a sprzęt musi być regularnie sprawdzany i kalibrowany.

Metody wykrywania E.coli stosowane obecnie

Obecnie metody, które wykrywają i potwierdzają obecność E. coli, wykorzystują enzym beta-D-glukuronidazę, unikalny enzym konstytutywny stwierdzony u E. coli, a także u niektórych rodzajów z rodziny Enterobacteriaceae (Shigella i Salmonella), natomiast nieobecny u innych bakterii z grupy coli. Najczęściej stosowane metody wykrywania E. coli i beta-D-glukuronidazy wykorzystują zdolność hydrolizy 4-metylombeliferylo-beta-D-glukuronidu (MUG) z wytworzeniem 4-metylombelliferonu, który fluoryzuje w świetle UV o długości fali ok. 360 nm. Inne metody detekcji wykorzystują różne substraty chromogenne, np. 3-indolyl-R, 5-bromo-3-indolyl-R, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-R, 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-R, 6-chloro-3-indolyl-R czy też 6-fluoro-3-indolyl-R (R=glukuronid). Jednak najczęściej spotykanymi substratami chromogennymi stosowanymi dla wykrywania beta-D-glukuronidazy są 5-bromo-4-chloro-3-indolylo glukuronid (kolor niebieski) lub p-nitrofenylo beta-D-glukuronid (kolor żółty). Często metody oparte na wykrywaniu enzymów, które wykorzystują określoną mieszaninę substratową, również hamują wzrost bakterii innych niż bakterie z grupy coli, co znacznie ułatwia detekcję i nie powoduje zakłóceń w odczycie wyników.

Rutynowa kontrola wody w kierunku bakterii grupy coli i E. coli najczęściej opiera się na metodzie filtracji membranowej, wykorzystującej agar chromogenny (zawierający 2–3 substraty chromogenne) oraz inkubację w temperaturze 37 °C. (rys. 2).

Rys. 2. Wzrost bakterii Escherichia coli (kolonie fioletowe) na agarze chromogennym

Wykrywanie bakterii grupy coli jest oparte na zdolności tych bakterii do tworzenia beta-D-galaktozydazy. Jednak i tu zaleca się wykonanie dodatkowych testów potwierdzających: dla bakterii grupy coli testów dla wykrywania oksydazy, a dla bakterii Escherichia coli – oprócz detekcji beta-D-glukuronidazy – sprawdzenia fermentacji laktozy w temperaturze 44 °C oraz produkcji indolu z tryptofanu. Liczne badania naukowe oraz raporty z badań laboratoryjnych wielokrotnie bowiem udowadniały, że standardowe analizy dla grupy coli i E. coli są niewystarczające i mogą dawać fałszywie dodatnie/ujemne wyniki. Okazało się bowiem, że niektóre szczepy E. coli mogą nie tworzyć beta-D-glukuronidazy, tworzenie indolu z tryptofanu w temperaturze 44 °C nie jest cechą wyłączną dla E. coli, gdyż np. niektóre szczepy z rodzaju Klebsiella, np. K. oxytoca dają pozytywne testy na obecność tryptofanazy. Ponadto, niektóre szczepy E. coli są indolo-ujemne, a nawet nie wykazują zdolności wzrostu w temp. 44 °C. Konwencjonalne testy na obecność bakterii grupy coli i E. coli, wykorzystujące metodę filtracji membranowej i wzrost w obecności substratów chromogennych, są czasochłonne gdyż wymagają potwierdzenia. Wobec tego poszukiwane są nowe metody dające jednoznaczne wyniki w wykrywaniu i identyfikacji tych bakterii. Ta strategia badawcza została zastosowana w komercyjnym teście Colilert, pozwalającym na jednoczesne badanie ilościowe liczby bakterii grupy coli i E. coli w wodzie bez potrzeby przeprowadzania badań potwierdzających. Ta technologia wykorzystuje specyficzne substraty, ONPG (o-nitrofenylo-beta-D-galaktopiranozyd) i MUG (4-metyloumbelliferylo-beta-D-glukuronid), hydrolizowane odpowiednio przez beta-galaktozydazę i beta-glukuronidazę. Bakterie z grupy coli obecne w 100 ml próbki wody metabolizują bezbarwny ONPG i uwalniają żółty wskaźnik (rys. 3).

Rys. 3. Testy Colilert po inkubacji

Z kolei pałeczki E. coli hydrolizują bezbarwny MUG i uwalniają niebieski fluorogen, widoczny w świetle UV o długości fali 365 nm (rys. 4).

Rys. 4. Test Colilert po inkubacji oglądany w świetle UV

Ponieważ aktywności tych dwóch enzymów są bardzo specyficzne, inne bakterie obecne w wodzie w tych warunkach nie są zdolne do wzrostu i ewentualnej ingerencji w końcowy wynik testu.

Wyniki badań porównawczych, prowadzone w Katedrze Biotechnologii Środowiskowej Politechniki Łódzkiej, obejmujące analizę sanitarną różnych prób wody w kierunku bakterii grupy coli i E. coli, przedstawiono w tabeli. Badania wykonano metodą filtracji membranowej, inkubując filtry na podłożu Chromocult Coliform Agar oraz metodą Colilert.

Tabela. Obecność bakterii grupy coli i E. coli w próbkach wody – oznaczenie ilościowe w 100 ml wody metodą filtracji membranowej (FM) oraz Colilert

Uzyskane współczynniki korelacji dla wyników uzyskanych dwiema metodami wynosiły 0,985025 dla bakterii grupy coli oraz 0,986066 dla E. coli.

Podsumowanie

Metoda Colilert ma kilka zalet w porównaniu z filtracją membranową. Największe znaczenie mają korzyści dla zdrowia publicznego wynikające ze skróconej analizy próbek wody. Eliminacja kroków potwierdzających, stosowanych w tradycyjnych metodach, oszczędza około 24–48 godzin. Test Colilert jest szybki i łatwy w wykonaniu oraz interpretacji wyników. Metodyka Colilert opiera się na aktywności enzymatycznej, która w mniejszym stopniu zależy od stanu fizjologicznego bakterii w porównaniu z metodami hodowlanymi. To bardzo ważne, bowiem zmiany w składzie chemicznym wody, temperatura oraz pH mogą powodować stres komórkowy i w konsekwencji hamować wzrost bakterii na selektywnych podłożach agarowych. W tych niesprzyjających warunkach bakterie przechodzą często w stan niehodowalności, znany jako stan VBNC (ang. Viable but Non-Culturable). W tym stanie fizjologicznym bakterie nie są zdolne do wzrostu, ale wykazują określone aktywności enzymatyczne, np. funkcje oddechowe, integralność membran i transkrypcję genów. Zatem analizy enzymatyczne mają tu zdecydowaną przewagę nad metodami hodowlanymi w wykrywaniu bakterii w środowisku wodnym. Metoda Colitert została już zatwierdzona lub zaakceptowana dla analizy wód pitnych w kilku krajach Unii Europejskiej, również w Polsce.

Literatura

1. Kręgiel D. Testy Colilert® – Szybkie wykrywanie oraz ilościowe oznaczanie bakterii grupy coli. Laboratorium – Przegląd Ogólnopolski, 2013, 3–4, 32–35.
2. Otlewska A., Dybka K., Kręgiel D. System Colilert – postęp w analizie mikrobiologicznej wody. Przemysł Spożywczy, 2013, 3, 18–22.
3. Sundram A., Bailey I.W., Green E. The application of new technology used for identifying bacteria from water samples. WISA 2000 Biennial Conference, Sun City, South Africa, 2000.

Artykuł jest częścią opracowania - WODA I HIGIENA W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM