Wraz ze wzrostem świadomości społecznej na temat alergii, coraz ważniejsze staje się precyzyjne wykrywanie alergenów w produktach spożywczych. Metoda ELISA oraz jej odmiany, takie jak ELISA bezpośrednia, pośrednia, "sandwich" i konkurencyjna, są niezawodnymi narzędziami w identyfikacji alergenów dzięki swojej wysokiej czułości i specyficzności. Ścisłe przestrzeganie protokołów laboratoryjnych, w tym precyzyjne pipetowanie i dokładne płukanie, jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników. W odpowiedzi na potrzebę szybkiego przetwarzania dużych ilości próbek, automatyzacja metod ELISA staje się coraz bardziej popularna. Automatyzacja nie tylko minimalizuje ryzyko błędów ludzkich, ale także zwiększa efektywność pracy laboratoriów diagnostycznych.

Alergeny pokarmowe

Alergeny pokarmowe, to specyficzne białka zawarte w żywności, które mogą wywoływać reakcje alergiczne u osób wrażliwych. Symptomy te różnią się intensywnością – mogą być łagodne, takie jak wysypka, lub poważne, zagrażające życiu, jak anafilaksja. Typowe objawy alergii pokarmowej to wymioty, biegunka, ból brzucha i gorączka.

Alergia pokarmowa jest rosnącym problemem na skalę globalną, stanowiącym poważne wyzwanie dla bezpieczeństwa żywności i zdrowia publicznego. Szacuje się, że dotyka około 8% dzieci i 3-10% dorosłych, przy czym jej występowanie wzrasta z roku na rok.

W ramach odpowiedzi na ten problem, Unia Europejska wdrożyła liczne akty prawne mające na celu zadbanie o bezpieczeństwo konsumentów. Jednym z najważniejszych dokumentów jest Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1169/2011 z dnia 25 października 2011 r., które reguluje przepisy dotyczące informowania konsumentów o alergenach w żywności, co ma na celu ochronę osób z alergiami pokarmowymi. Wymaga ono, by producenci żywności odpowiednio etykietowali produkty, zarówno przedpakowane, jak i nieprzedpakowane, wyraźnie wyróżniając alergeny w liście składników. Zgodnie z tym rozporządzeniem wszyscy producenci żywności są zobligowani do umieszczania na etykietach produktów informacji o obecności czternastu głównych alergenów pokarmowych, gdy są one używane jako składniki. Są to:

• zboża zawierające gluten, takie jak pszenica, żyto, jęczmień, owies, orkisz, kamut oraz ich szczepy hybrydowe,
• orzeszki ziemne (zwane także fistaszkami),
• orzechy, takie jak migdały, orzechy laskowe, orzechy włoskie, orzechy brazylijskie, nerkowce, orzechy pekan, pistacje, makadamia i orzechy z Queensland,
• ryby,
• skorupiaki (obejmują kraby, homary, krewetki i langusty),
• mięczaki (obejmują małże, szczeżuje, ostrygi, przegrzebki, kałamarnice i ośmiornice),
• nasiona sezamu,
• jajka,
• mleko i produkty mleczne (w tym laktoza),
• soja,
• seler,
• łubin,
• gorczyca,
• dwutlenek siarki i siarczyny w stężeniach powyżej 10 mg na kg lub 10 mg na litr, wyrażone jako SO₂.

Metoda ELISA

Obecnie najpowszechniej stosowaną metodą analityczną do wykrywania i ilościowego oznaczania alergenów w produktach spożywczych jest test ELISA (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Technika ta charakteryzuje się wysoką czułością i specyficznością, jest stosunkowo niedroga i łatwa do wykonania. Metodę tę po raz pierwszy opisali Engvall i Perlmann w 1971 r., którzy to wykorzystali znakowane enzymatycznie przeciwciała do ilościowego oznaczania klasy immunoglobulin IgG. Metoda ta jest zwykle przeprowadzana na 96 - dołkowych płytkach polistyrenowych i polega na tworzeniu wiązań pomiędzy antygenem a specyficznym przeciwciałem. Wiązania te stają się widoczne w wyniku reakcji barwnej, która zachodzi pod wpływem enzymów sprzężonych z przeciwciałami oraz odpowiednich (dla tych enzymów) substratami. Intensywność zabarwienia zależy od liczby powstałych kompleksów antygen-przeciwciało i jest zwykle mierzona kolorymetrycznie za pomocą spektrofotometru.

Na przestrzeni lat technika ELISA była szeroko wykorzystywana przez laboratoria diagnostyczne i naukowe do licznych analiz, co tym samym powodowało dalszy jej rozwój oraz powstanie różnych jej odmian. Obecnie wyróżniamy cztery główne typy ELISA:

• ELISA bezpośrednia
• ELISA pośrednia
• ELISA kanapkowa (typu "sandwich")
• ELISA konkurencyjna

Wybór konkretnej odmiany metody ELISA zależy od kilku czynników, m.in. od badanego materiału i celu badania (detekcja antygenu czy przeciwciała), czy oczekiwanej czułości oraz specyficzności danej reakcji. Mimo, że wspomniane odmiany ELISA charakteryzują się odmiennym zastosowaniem, to ogólny protokół postępowanie dla wszystkich typów tej metody jest bardzo podobny. Obejmuje on następujące etapy:

• Opłaszczenie fazy stałej (antygenem lub przeciwciałem).
• Blokowanie wolnych miejsc zwykle z dodatkiem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu uniemożliwienia nieselektywnego wiązania białek do fazy stałej podczas kolejnych etapów analizy.
• Dodanie badanej próbki i powstanie kompleksu immunologicznego antygen-przeciwciało.
• Detekcja – dodanie koniugatu (przeciwciała wyznakowanego enzymem, np. peroksydazą chrzanową, HRP), który wiąże się z antygenem/przeciwciałem. Następnie dodaje się substrat (np. TMB – tetrametylobenzydyna) odpowiedni dla danego enzymu, w wyniku czego zachodzi reakcja i następuje zmiana barwy roztworu. W celu zatrzymania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór hamujący, np. H₂SO₄
• Odczyt wyników - pomiar natężenie barwy za pomocą spektrofotometru i odczyt ilość badanego analitu w oparciu o krzywą kalibracyjną.

Między każdym z wyżej wymienionych kroków znajduje się etap „płukania” płytki przy użyciu odpowiedniego buforu płuczącego. Ma on na celu usunięcie nadmiaru niezwiązanego odczynnika. Etap ten jest powtarzany za każdym razem dwa lub więcej razy, w zależności od konkretnego protokołu.

Podczas przeprowadzania badań metodą ELISA, kluczowe znaczenie dla wiarygodności wyników mają precyzja przygotowania i pipetowania odczynników oraz dokładność procedur. Wysoka jakość badań zależy od wielu czynników, które minimalizują ryzyko błędów.

Oto kilka najważniejszych zasad, które mają bezpośredni wpływ na końcowy wynik ELISA:

Podstawową zasadą jest unikanie wymiany komponentów między różnymi zestawami lub partiami, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na wyniki testów ELISA. Niezawodność tych testów jest gwarantowana tylko do określonej daty ważności. Testy ELISA składają się z wielu komponentów, które są optymalizowane i testowane razem, aby zapewnić spójność wyników pomiędzy poszczególnymi partiami. Formulacje i stężenia większości składników są specjalnie dostosowane do każdego zestawu, co dodatkowo podkreśla znaczenie ich właściwego używania.

Przed przystąpieniem do testów ELISA, niezbędne jest doprowadzenie wszystkich odczynników do temperatury pokojowej. Dzięki temu zapewniona zostaje odpowiednia kinetyka reakcji enzymatycznych oraz wiązania antygen-przeciwciało. Jeśli nie planuje się wykorzystania całej płytki wielodołkowej, pozostałe stripy należy starannie zapakować w torbę z pochłaniaczem wilgoci. Zapobiegnie to degradacji składników spowodowanej przez wilgoć, która może negatywnie wpływać na aktywność powierzchni dołków.

Należy zawsze pamiętać o stosowaniu kontroli dodatnich i ujemnych oraz odpowiednich standardów. Standardy te służą do tworzenia krzywej kalibracyjnej, która umożliwia obliczenie stężeń badanych próbek. Kontrole i standardy odniesienia powinny być włączone do każdej analizy przeprowadzanej metodą ELISA.

Technika pipetowania jest kluczowym elementem pracy laboratoryjnej, mającym istotny wpływ na uzyskanie powtarzalnych wyników analizy ELISA. Zaleca się używanie pipet wielokanałowych podczas dodawania poszczególnych odczynników, takich jak koniugat czy substrat. Pipety te znacząco przyspieszają i standaryzują dozowanie reagentów, głównie przez zmniejszenie różnic w czasach inkubacji poszczególnych próbek, co przekłada się na bardziej jednorodne wyniki.

Podczas pipetowania ciecz należy aplikować, trzymając końcówki pipety pod odpowiednim kątem, aby nie dotykały dna dołków płytki mikrotitracyjnej. Takie podejście minimalizuje ryzyko kontaminacji krzyżowej i zapewnia równomierne rozprowadzenie próbek. Ponadto, kluczowe jest pamiętanie o wymianie końcówek pipety między różnymi próbkami lub standardami, aby unikać zanieczyszczenia krzyżowego.

Jednym z kluczowych etapów w procedurze ELISA jest płukanie płytki. Niedokładne przemywanie dołków może prowadzić do niejednorodnego usunięcia reagentów i powodować wysokie tło reakcji, co negatywnie wpływa na czułość testu. Z tego powodu zaleca się korzystanie z automatycznych myjek do mikropłytek ELISA, które zapewniają bardziej równomierne i efektywne płukanie niż metody manualne. Zalecane jest również 30-sekundowe namaczanie płytki między kolejnymi cyklami płukania, co umożliwia buforowi płuczącemu bardziej efektywne działanie. Po zakończeniu ostatniego płukania, należy usunąć resztki roztworu, odwracając płytkę i osuszając ją czystymi ręcznikami papierowymi. Ważne jest, aby płytki nie wyschły przed dodaniem kolejnego odczynnika testowego przed dodaniem kolejnego odczynnika.

Aby osiągnąć powtarzalne wyniki, kluczowe jest przestrzeganie protokołu, niezależnie od tego, czy jest to protokół dostarczony z zakupionym zestawem, czy opracowana wewnętrznie metoda. Wymaga to odpowiedniego przygotowania próbek, stosowania zoptymalizowanych warunków badania oraz ścisłego przestrzegania czasów i temperatur inkubacji. Zaleca się, aby czas nie odbiegał o więcej niż +/- 5 minut na każdą godzinę inkubacji.

Podczas wykonywania metody ELISA, utrzymanie odpowiedniej temperatury inkubacji jest kluczowe. Protokół może wymagać inkubacji w chłodnym środowisku (2-8 °C) lub w temperaturze wyższej niż pokojowa, np. 37 °C. Gdy przeprowadza się liczne testy jednocześnie, nie należy układać płytek wielodołkowych jedna na drugiej. Rozmieszczanie ich pojedynczo na półkach chłodziarki czy inkubatora zapewnia równomierny rozkład temperatury, co jest niezbędne do zapewnienia spójności wyników.

Przestrzeganie właściwych technik pipetowania, dokładne płukanie oraz stosowanie się do pozostałych wymienionych procedur są kluczowe dla zwiększenia precyzji i powtarzalności badań metodą ELISA, minimalizując typowe błędy związane z niewłaściwym pipetowaniem oraz zanieczyszczeniem próbek. Zważywszy na liczne procedury, których należy przestrzegać, oraz wyzwania, przed którymi mogą stanąć nowi laboranci wykonujący dużą ilość badań, zastosowanie automatyzacji w procesach ELISA staje się niezbędne. Automatyzacja może znacząco przyczynić się do redukcji potencjalnych źródeł zmienności i usprawnić pracę laboratorium, co jest szczególnie istotne w intensywnie pracujących placówkach badawczych.

Automatyzacja badań ELISA

Współczesne laboratoria potrzebują rozwiązań, które zwiększą efektywność, zmniejszą ilość odpadów oraz zapewnią wysoką dokładność i powtarzalność badań. Analizator BOLT™ jest idealnym rozwiązaniem na te wyzwania, oferując szereg zalet, które czynią go niezbędnym narzędziem w każdym nowoczesnym laboratorium.

Analizator BOLT™ to nowoczesne, w pełni zautomatyzowane urządzenie, zaprojektowane do przeprowadzania testów ELISA oraz chemiluminescencyjnych (CLIA). Dzięki jednopłytkowej konstrukcji i modułowej budowie, BOLT oferuje konfigurację dostosowaną do indywidualnych potrzeb laboratorium, co czyni go ekonomicznie efektywnym rozwiązaniem. Urządzenie może przeprowadzić jednocześnie analizę 96 próbek. Przy czym podczas jednej analizy może oznaczać do 4 różnych parametrów (np. cztery rodzaje alergenów).

Jedną z najistotniejszych zalet analizatora BOLT™ jest jego zdolność do pracy bez zużywania końcówek do pipet, co nie tylko obniża koszty eksploatacji laboratorium, ale także redukuje ilość plastikowych odpadów. Taka ekologiczna postawa wpisuje się w zrównoważony rozwój, jednocześnie utrzymując wysoką jakość i precyzję badań.

Analizator BOLT™ automatyzuje wszystkie etapy analizy ELISA, minimalizując ryzyko błędów ludzkich i zapewniając wyjątkową precyzję oraz powtarzalność wyników. Dzięki temu laboranci mogą skupić się na bardziej złożonych aspektach pracy diagnostycznej, podnosząc standardy jakości badań. Integracja funkcji w analizatorze BOLT™, obejmująca spektrofotometr, automatyczną myjkę do płytek ELISA oraz inkubator, przekłada się na oszczędność przestrzeni i czasu potrzebnego na przygotowanie i wykonanie analiz.

Analizator BOLT™ skutecznie radzi sobie z problemami związanymi z pipetowaniem, które często mogą prowadzić do błędów w badaniach, takich jak nieprawidłowe dozowanie i zanieczyszczenia krzyżowe. Automatyzacja procesu pipetowania eliminuje ryzyko błędów ludzkich i zwiększa spójność wyników. BOLT™ zapewnia precyzyjne i powtarzalne dozowanie reagentów i próbek, co jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników testów. Wykorzystanie zautomatyzowanych systemów dozowania minimalizuje również ryzyko kontaminacji krzyżowej, co jest szczególnie ważne przy pracy z wysoko czułymi próbkami biologicznymi.

BOLT™, wyposażony jest w interaktywne, intuicyjne oprogramowanie, które upraszcza obsługę urządzenia, czyniąc doświadczenie laboratoryjne bardziej przystępnym. Dodatkowo, analizator jest kompatybilny z systemami LIMS i zapewnia wysoką precyzję działania. Umożliwia automatyczne zarządzanie wszystkimi etapami analiz opartych na płytkach – od wstępnego mieszania próbek po ostateczne przetwarzanie danych.

Wśród zweryfikowanych zestawów testowych ELISA dostępnych na BOLT™ znajdują się między innymi zestawy firmy Gold Standard Diagnostics do wykrywania alergenów, mykotoksyn oraz pozostałości leków weterynaryjnych. Protokoły dla tych testów zostały już zweryfikowane i są gotowe do implementacji na urządzeniu klienta, a niestandardowe metody mogą być rozwijane i walidowane zgodnie z określonymi specyfikacjami.

Podsumowanie

W kontekście produkcji żywności, konieczność badania obecności alergenów staje się niezmiernie istotna dla producentów, mając na względzie bezpieczeństwo konsumentów i przestrzeganie przepisów prawnych. Automatyzacja metody ELISA poprzez urządzenie BOLT™ przynosi liczne korzyści, eliminując potrzebę stosowania końcówek do pipet, co zmniejsza ilość odpadów laboratoryjnych i wpływa pozytywnie na ekologiczny charakter badań. Dodatkowo, system ten gwarantuje wysoką jakość i powtarzalność wyników, dzięki precyzyjnej kontroli pipetowania i minimalizacji ryzyka zanieczyszczeń krzyżowych. Dla laboratoriów szukających niezawodnych i ekonomicznych rozwiązań, które zwiększają wydajność pracy przy zachowaniu najwyższych standardów jakości, to urządzenie może okazać się kluczowym narzędziem pracy.

Literatura

Shah K, Maghsoudlou P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. Br J Hosp Med (Lond). 2016 Jul;77(7):C98-101. doi: 10.12968/hmed.2016.77.7.C98. PMID: 27388394.

Hosseini, Samira, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): from A to Z. Singapore:: Springer, 2018.

ROZPORZĄDZENIE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY (UE) NR 1169/2011 z dnia 25 października 2011 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat żywności, zmiany rozporządzeń Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1924/2006 i (WE) nr 1925/2006 oraz uchylenia dyrektywy Komisji 87/250/EWG, dyrektywy Rady 90/496/EWG, dyrektywy Komisji 1999/10/WE, dyrektywy 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady, dyrektyw Komisji 2002/67/WE i 2008/5/WE oraz rozporządzenia Komisji (WE) nr 608/2004

 TEN ARTYKUŁ JEST CZĘSCIĄ OPRACOWANIA FOODFAKTY NAWIGATOR, KTÓRY DOSTĘPNY JEST DO POBRANIA ZA DARMO DZIĘKI PARTNEROM MERYTORYCZNYM WARSZTATÓW I FORUM WIEDZY MANAGERSKIEJ FOODFAKTY SCIENCE 4 BUSINESS -  ZAGROŻENIA MIKROBIOLOGICZNE I BIOLOGICZNE ŻYWNOŚCI ORAZ INNE UZUPELNIAJĄCE ZAGADNIENIA (4-5 WRZEŚNIA 2024, ŁÓDŹ)