Metody Real-Time PCR od lat stanowią fundament szybkiej i wiarygodnej diagnostyki mikrobiologicznej w przemyśle spożywczym. W praktyce jednak ich skuteczność nie zależy wyłącznie od samej technologii, lecz w dużym stopniu od cech badanej matrycy.

W przypadku produktów złożonych oraz o niskiej aktywności wody w czasie amplifikacji DNA może pojawić się zjawisko, które bywa często pomijane – częściowa inhibicja. Nie prowadzi ona do całkowitego zatrzymania reakcji, ale może w sposób „cichy” obniżyć jej wydajność, zwiększając ryzyko uzyskania fałszywie ujemnych bądź wątpliwych wyników. Jest to szczególnie istotny aspekt w kontekście patogenów występujących na niskim poziomie w żywności, takich jak na przykład gatunki z rodzaju Salmonella spp. w produktach suchych.

Częściowa inhibicja występuje wtedy, gdy składniki obecne w produktach spożywczych – takie jak tłuszcze, polifenole, białka, czy przyprawy – zakłócają proces ekstrakcji DNA lub jego amplifikacji. Osłabia to wydajność reakcji i zwiększa ryzyko uzyskania wyników, które nie zawsze odzwierciedlają rzeczywisty stan próbki. Aby zapewnić wiarygodność wyników, laboratoria powinny stosować zwalidowane procedury obejmujące wtórne namnażanie oraz wbudowane kontrole wewnętrzne. Pozwalają one na regenerację uszkodzonych komórek, rozcieńczenie inhibitorów oraz identyfikację reakcji dotkniętych inhibicją, zanim doprowadzą one do błędnej interpretacji wyników.

Które produkty spożywcze najczęściej powodują inhibicję?

Wiele popularnych produktów spożywczych, ze względu na swój skład, zawiera naturalne inhibitory reakcji PCR. Do najbardziej wymagających matryc należą:

• kakao i czekolada - wysoka zawartość tłuszczów i polifenoli,

• pasty i masła orzechowe - duża ilość lipidów utrudniających ekstrakcję,

• przyprawy oraz zioła - obecność polisacharydów, wapnia i olejków eterycznych,
• produkty wysokotłuszczowe i wysokobiałkowe - zdolność wiązania jonów magnezu niezbędnych dla enzymów PCR.

Zawarte w tych produktach tłuszcze, polifenole, polisacharydy, czy związki mineralne mogą wiązać się z DNA lub je degradować, blokować aktywność polimerazy, zmieniać dostępność jonów lub utrudniać ekstrakcję. Pomimo różnic, wszystkie te matryce prowadzą do tego samego efektu: obniżonej wydajności amplifikacji i zwiększonego ryzyka niewykrycia niskiego poziomu kontaminacji.

Największym wyzwaniem związanym z częściową inhibicją jest jej subtelny charakter. Reakcja amplifikacji przebiega pozornie prawidłowo, krzywa amplifikacyjna może być nadal widoczna, jednak ilość wykrywalnego DNA jest zmniejszona. Analiza nie ulega zatem całkowitemu niepowodzeniu, niemniej graniczne poziomy zanieczyszczenia mogą spaść poniżej progu wykrywalności dla metody. Wówczas sygnał pojawia się później lub jest słabszy niż oczekiwano, co zwiększa ryzyko przeoczenia rzeczywistego zanieczyszczenia produktu drobnoustrojami patogennymi.

Dlaczego produkty o niskiej aktywności wody stanowią dodatkowe ryzyko?

Produkty takie jak kakao, czekolada, pasty orzechowe, czy produkty w formie proszków od dawna są powiązane z obecnością drobnoustrojów z rodzaju Salmonella, ale stwarzają także dodatkowe wyzwania biologiczne. Środowiska suche sprzyjają powstawaniu komórek bakteryjnych w stanie stresu lub uszkodzenia, które nadal mogą wywoływać choroby. Ze względu na spowolnioną regenerację i ograniczoną dynamikę namnażania, komórki te mogą nie osiągnąć poziomu umożliwiającego detekcję w czasie wymaganym przez metody molekularne.

Zanieczyszczenie w takich produktach często występuje na poziomie frakcyjnym – nawet jednej komórki na 100 g próbki. W sytuacji, gdy amplifikacja jest dodatkowo hamowana, właśnie takie graniczne poziomy jako pierwsze przestają być wykrywalne. Dodatkowo, w środowisku o niskiej wilgotności patogeny z rodzaju Salmonella mogą przetrwać przez miesiące, a nawet lata, stanowiąc zagrożenie przez cały okres przydatności produktu do spożycia.

Praktyczne kroki ograniczające ryzyko inhibicji

Ograniczenie inhibicji zaczyna się przede wszystkim od wyboru odpowiedniej metody analitycznej. Laboratoria powinny:

1. Stosować zwalidowane metody dostosowane do analizowanych matryc.

Każda matryca żywności zachowuje się inaczej podczas analizy, dlatego niezbędna jest szeroka walidacja metod. Organizacje takie jak AOAC, ISO, Health Canada, AFNOR, MicroVal czy NordVal wymagają zwalidowania metod na szerokim zakresie produktów spożywczych, aby zapewnić uzyskiwanie wiarygodnych wyników. Zwalidowane metody obejmujące różne typy matryc, od niskowilgotnych, wysokotłuszczowych, wysokobiałkowych po złożone, co pozwala laboratoriom na uzyskanie pewności do otrzymywanych wyników.

2. Rozważać zastosowanie wtórnego namnażania.

Wtórne namnażanie (dwuetapowe) często stanowi bardziej wiarygodne podejście w przypadku matryc zawierających inhibitory. W przeciwieństwie do stosowania rozcieńczania izolatu DNA, pozwala ono jednocześnie zwiększyć liczbę komórek docelowych oraz zmniejszyć wpływ inhibitorów. W trakcie wzrostu hodowli komórki w stanie stresu regenerują się, a substancje hamujące ulegają rozcieńczeniu w większej objętości podłoża wzbogacającego. Dzięki temu możliwe jest zwiększenie skuteczności detekcji bez utraty czułości metody. W przypadku trudnych matryc, takich jak kakao, czekolada, czy pasty orzechowe, dostępne są zwalidowane procedury wtórnego namnażania, które zapewniają spójność i wiarygodność wyników.

3. Korzystać z metod zawierających kontrole wewnętrzne amplifikacji.

Kontrole wewnętrzne amplifikacji odgrywają kluczową rolę w identyfikacji inhibicji przed uzyskaniem błędnego wyniku. Jeśli kontrola wewnętrzna nie ulega amplifikacji, wynik oznaczany jest jako niejednoznaczny, a nie ujemny. Pozwala to uniknąć błędnej interpretacji inhibicji jako rzeczywistego braku patogenu. Test diagnostyczny powinien nie tylko wykrywać patogeny, ale również potwierdzać prawidłowy przebieg reakcji. Kontrole wewnętrzne zapewniają tę weryfikację i zwiększają wiarygodność wyników ujemnych.

4. Rozważać izolację DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych.

Izolacja DNA z użyciem kulek magnetycznych stanowi jedno z najbardziej efektywnych podejść do ograniczania wpływu inhibitorów obecnych w złożonych matrycach żywności. Technologia ta opiera się na selektywnym wiązaniu kwasów nukleinowych do powierzchni kulek, co umożliwia ich skuteczne oddzielenie od substancji zakłócających, takich jak tłuszcze, białka, czy polifenole. W porównaniu do tradycyjnych metod ekstrakcji, podejście to pozwala uzyskać wyższej jakości DNA, bardziej oczyszczone z inhibitorów, co bezpośrednio przekłada się na stabilność i wydajność reakcji PCR. Jest to szczególnie istotne w przypadku trudnych matryc, gdzie obecność inhibitorów może znacząco obniżać czułość detekcji.

Podsumowanie

Częściowa inhibicja jest często niewidocznym czynnikiem wpływającym na wyniki badań mikrobiologicznych, szczególnie w przypadku złożonych i niskowilgotnych produktów spożywczych. Nie zatrzymuje ona całkowicie reakcji PCR, ale może znacząco osłabić sygnał niezbędny do wykrycia niskiego poziomu kontaminacji.

Stosowanie zwalidowanych metod Real-Time PCR, kontroli wewnętrznych, procedur namnażania próbki oraz izolacji DNA specyficznych dla danej matrycy pozwala zwiększyć wiarygodność wyników ujemnych.

W praktyce oznacza to konieczność świadomego podejścia do całego procesu analitycznego – od przygotowania próbki po interpretację wyników.

Hygiena® oferuje szerokie portfolio zwalidowanych testów w Systemie BAX® Q7 oraz testach foodproof® zatwierdzonych do badania nawet najbardziej wymagających matryc spożywczych. Metody firmy Hygiena zostały zaprojektowane w celu wspierania wiarygodnych analiz i podejmowania decyzji w przypadku badań żywności oraz środowiska jej wytwarzania.