W literaturze naukowej możemy znaleźć takie stwierdzenia jak: „Pobieranie próbek i ich przygotowanie (mielenie) to największe źródła zmienności, które negują precyzję i dokładność oznaczania ilościowego mykotoksyn, szczególnie w przypadku ziaren” czy „Przygotowanie próbki jest jednym z kluczowych etapów dokładnej detekcji mykotoksyn”. Nie bez powodu, kiedy mówimy o mykotoksynach, na pierwszy rzut idzie analiza naszego próbkobrania – w jaki sposób to robiliśmy do tej pory, a może jak powinniśmy zacząć to robić. Dlaczego? Postaram się przybliżyć Państwu istotę problemu w poniższym artykule.

Na początku przybliżmy sobie definicję mykotoksyn - to grupa wtórnych metabolitów grzybów pleśniowych, głównie z rodzaju Penicillium, Aspergillus i Fusarium, które mogą wykazywać ostre działania toksyczne oraz mogą mieć właściwości: mutagenne (m.in. aflatoksyny, fumonizyny, ochratoksyna A, toksyna T-2); teratogenne (m.in. ochratoksyna A, aflatoksyna B1, toksyna T-2, deoksyniwalenon); estrogenne (zearalenon). Możemy je podzielić ze względu na miejsce ich występowania na:

1. Grzyby atakujące rośliny podczas uprawy (Fusarium) – trichoteceny (DON, T-2, HT-2), fumonizyny, zearalenon.
2. Grzyby atakujące produkty roślinne w trakcie magazynowania i obróbki technologicznej (Aspergillus, Penicillium) – aflatoksyny.

Mykotoksyny, będące toksynami pochodzenia grzybowego, stanowią grupę analitów punktowych, co oznacza, że ich obecność w zbożach nie jest jednorodna. To zjawisko wynika z nierównomiernego rozkładu grzybów produkujących mykotoksyny na powierzchni i wewnątrz materiału roślinnego. Warto zwrócić uwagę, iż grzyby produkujące mykotoksyny, rozwijają się w warunkach sprzyjających, takich jak wilgoć, wyższa temperatura czy obecność uszkodzeń mechanicznych ziarna. W rezultacie, ich obecność może być skoncentrowana w określonych obszarach partii surowca. Dlatego kluczowym aspektem w skutecznej analizie mykotoksyn jest precyzyjne pobieranie próbek oraz odpowiednia ich homogenizacja. Prawidłowe pobieranie umożliwia uwzględnianie różnic w stężeniach mykotoksyn w różnych obszarach danego surowca.

Ryc.1. Nierównomierne rozłożenie mykotoksyn w badanym materiale

Próbkobranie

Według polskiego Rozporządzenia Komisji (WE) NR 401/2006 z dnia 23 lutego 2006 r., które ustanawia metody pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli poziomów mykotoksyn w środkach spożywczych, znajdziemy informację, iż „Pobieranie próbek ma istotne znaczenie dla precyzyjnego oznaczenia poziomów mykotoksyn, których rozmieszczenie w partii jest niejednorodne. A zatem należy ustalić kryteria ogólne, które powinna spełniać metoda pobierania próbek.”. W dokumencie znajdziemy takie informacje, jak ogólne zasady pobierania próbek zboża i produktów zbożowych czy liczbę próbek pierwotnych, które należy pobrać w zależności od masy partii zbóż i produktów zbożowych.

Dla przykładu dotyczącego masy partii a liczby próbek pierwotnych – aby próba była reprezentatywna, należy ją pobrać z kilku punktów partii, np. dla 1 tony ziarna należy pobrać 10 próbek pierwotnych po 100g, uzyskując próbkę zbiorczą o wadze 1kg.

Ciekawe badanie przeprowadzone w 2021 roku przez Joseph Kumphanda i in., wykazało, iż w ciągu ostatnich 3 dekad nastąpił znaczny spadek masy zmielonej próbki i porcji testowej wykorzystywanych w analizie mykotoksyn w kukurydzy. Analiza wykazała, iż wysokie koszty odczynników, wydłużony czas potrzebny na przygotowanie i przetwarzanie próbki oraz zwiększone zasoby potrzebne do usunięcia nadmiaru próbki przyczyniły się do zmniejszenia wielkości próbek laboratoryjnych i porcji testowych kosztem zwiększenia całkowitej wariancji wyników testów.

Przechowywanie

Ważne jest również przechowywanie naszej próbki. Należy pamiętać, iż ziarno pozostaje „żywym” plonem również po zbiorze – oddycha i jest podatne na infekcje pleśnią czy inwazje przez szkodniki. Istotnym jest również monitorowanie temperatury i wilgotność podczas przechowywania.

Stopień zmielenia

Na rynku jest wiele firm oferujących odpowiedniej jakości młynki laboratoryjne – ważne jest to, czy jest on odpowiedni do danej grupy surowców. Np. trudno będzie uzyskać odpowiednią frakcję zmielenia na wysoko wilgotnej kukurydzy. Frakcja zmielenia jest różna w zależności od wykonywanej metodyki, natomiast zasada jest „im drobniej zmielona jest próbka, tym mniejsza jest zmienność w analizowanej próbie”. Ważne jest czyszczenie młynka z pyłu przed rozpoczęciem kolejnej analizy, aby uniknąć kontaminacji oraz ewentualnego zafałszowania wyniku.

Również warto zwrócić uwagę na takie elementy jak:

- zapylenie w laboratorium – należy posiadać oddzielne pomieszczenie analityczne lub ustawić młynek w dalekiej odległości od miejsca, gdzie wykonywana jest analiza;

- zgodność działania z instrukcją testów – warto zwrócić uwagę na to jaka panuje temperatura w pomieszczeniu i czy jest ona zgodna z wymaganiami wykonywanej procedury testowej; jaka jest temperatura używanych odczynników; czy dana metodyka jest zwalidowana na badany surowiec czy produkt;

- kalibracja urządzenia, zachowanie jego czystości;

- dobra praktyka laboratoryjna – m.in. właściwe pipetowanie.

Podsumowując, należy pamiętać iż mykotoksyny jako analit punktowy wymagają szczególnej uwagi przy pobieraniu próbek oraz homogenizacji. Aby mieć pewność, że wyniki testu dokładnie odzwierciedlają mykotoksynę w stężeniu obecnym w partii, próbki muszą być reprezentatywne dla partii i wielkość pobranej próbki wystarczający, aby skompensować nierównomierne rozmieszczenie zanieczyszczeń. Staranne i reprezentatywne próbkowanie, wraz z dokładną homogenizacją, pozwalają na uzyskanie wyników analizy mykotoksyn, które odzwierciedlają rzeczywiste stężenia toksyn w badanym materiale. To z kolei ma kluczowe znaczenie dla oceny bezpieczeństwa żywności i ochrony zdrowia konsumentów przed potencjalnym działaniem szkodliwych substancji.

Bibliografia

• ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 1126/2007 z dnia 28 września 2007 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 1881/2006 ustalające najwyższe dopuszczalne poziomy niektórych zanieczyszczeń w środkach spożywczych w odniesieniu do toksyn Fusariumw kukurydzy i produktach z kukurydzy
• USDA, United States Department of Agriculture (Federal Grain Inspection Service) Washington, D.C., 2023.
• „Kontrola obecności mykotoksyn w produktach rolniczych i żywności. Cz. I. Praca przeglądowa”. Kowalska G., Kowalski R. AgronomyScience VOL. LXXV (3), 2020.
• „Biotechnologyand OtherNew ProductionTechnologies Annual“. SobolevD., GellerL. USDA, 2022.
• Adunphatcharaphoniinni, „The evolution of multiplex detection of mycotoxins using immunoassay platform technologies.” Journal of Hazardous Materials, Volume 432, 2022.
• Kumphandaiinni;. "Are sample size and sample preparation for mycotoxin quantitation in grain products getting trivialized?". Food Control, Volume 130, 2021.
• „OchratoksynaA, deoksyniwalenol, toksyny T-2 i HT-2 –występowanie w żywności i ich wpływ na organizm człowieka.” Kochman J., Jakubczyk K.P., Antoniewicz J., Janda K., Medycyna Ogólna i Nauki o Zdrowiu Tom 27, Nr 2, 117–120, 2021.
• „CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA ZANIECZYSZCZENIE ZBÓŻ MIKOTOKSYNAMI”. Podolska G., Instytut Uprawy, Nawożenia i Gleboznawstwa –PIB w Puławach, kwiecień-czerwiec 2 (175), 2013.
• A. Tittlemier, B. Cramer, C. Dall’Asta, M.C. DeRosa, V.M.T. Lattanzio, R. Malone, C. Maragos, M. Stranska, and M.W. Sumarah; World MycotoxinJournal2022 15:1, 3-25
• Toxins2022, 14(12), 819; https://doi.org/10.3390/toxins14120819
• https://yadda.icm.edu.pl/yadda/element/bwmeta1.element.baztech-a1ce5e5f-f1ab-4022-85e3-eacdcc8e7f5b
• http://pw.ihar.edu.pl/blog/2017/02/20/monitorowanie-obecnosci-mikotoksyn-w-ziarnie-kukurydzy/
• https://haldimandpress.com/grain-dust-an-underrated-health-risk/
• https://food.r-biopharm.com/news/sampling-the-key-to-reliable-analysis/