Dzisiejsze metody diagnostyczne mogą wykryć pojedynczą komórkę Listeria monocytogenes obecną w próbce ze środowiska produkcyjnego. Do jej wykrycia muszą być jednak spełnione podstawowe warunki. Przede wszystkim musimy ją znaleźć/pobrać w środowisku produkcyjnym, a następnie zachować jej żywotność podczas transportu do laboratorium i zachować jej zdolność do namnażania się aż do analizy. Na koniec pozostaje nam wybrać metodę detekcji, która może wpłynąć głównie na czas analizy.

Pobieranie próbek ze środowiska w celu wykrycia patogenów. Odpowiedni wybór narzędzi do pobierania próbek

Pobieranie próbek ze środowiska może nie być tak proste, jak mogłoby się wydawać. Do prawidłowego pobierania próbek konieczne jest użycie narzędzia, które:

• skutecznie pobiera drobnoustroje z badanej powierzchni,
• jest wystarczająco szorstkie i aseptycznie pobiera próbkę,
• nie zawiera biocydów,
• neutralizuje pozostałości środków dezynfekujących,
• utrzymuje żywotność komórek,
• nie koliduje z zastosowaną metodą diagnostyczną i nie powoduje wyników fałszywie dodatnich ani fałszywie ujemnych.

Pobór próbki

Artykuły do pobierania próbek (gąbki, wymazówki) muszą być zgodne z normą ISO 18593: 2018: 08 Mikrobiologia łańcucha pokarmowego – Metody horyzontalne określające techniki pobierania próbek z powierzchni.

Pod względem prostoty i łatwości użytkowania, gąbki są najczęściej wykorzystywane w praktyce do pobierania próbek.

Wielkość powierzchni

Zaleca się stosowanie sterylnej wymazówki do trudno dostępnych miejsc i obszarów 2. Do pobierania próbek z obszarów > 100 cm² zaleca się stosowanie gąbki. W celu wykrycia drobnoustrojów całkowita próbkowana powierzchnia powinna być jak największa (jeśli jest dostępna), aby zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia mikroorganizmów. Zaleca się pobranie próbki z powierzchni od 1000 cm² do 3000 cm² (np. 50 cm x 50 cm). Do próbkowania takiej powierzchni zaleca się użycie odpowiedniego narzędzia, np. gąbki poliuretanowej z uchwytem EZ Reach™, szerokiej, poliuretanowej wymazówki PUR Blue™ lub w przypadku mniejszych powierzchni wymazówki Veriswab™.

Zachowanie żywotności komórek

Zgodnie z normą ISO 18593:2018 próbkę wymazu należy dostarczyć do laboratorium w celu dalszej diagnostyki jak najszybciej, najlepiej w ciągu 24 godzin (schłodzoną!). Jeśli próbka nie zostanie od razu poddana analizie w laboratorium, można ją przechowywać w lodówce maksymalnie przez 48 godzin.

Medium transportowe

Skuteczna metoda pobierania próbek środowiskowych polega na zastosowaniu odpowiedniego transportowego / neutralizacyjnego bulionu dającego możliwość neutralizacji pozostałości środków dezynfekujących pobranych wraz z próbką i utrzymania żywotności poddanych stresowi komórek np. Listeria monocytogenes (Lm).

Badaniem porównującym trzy buliony neutralizujące do pobierania próbek środowiskowych w obecności małej liczby Listeria monocytogenes (poddanych stresowi i działaniu czwartorzędowych związków amonowych na powierzchni stali nierdzewnej)zajmował się Li et al. (2020). Nałożyli Lm na powierzchnię stali nierdzewnej i poddali ją procesowi suszenia przez 16-18 godzin w temperaturze pokojowej ( 21-24°C). Następnie zastosowano Whisper™ V, środek dezynfekujący na bazie czwartorzędowych związków amoniowych (QAC), rozcieńczony do 400 ppm i 8000 ppm aktywnego quatu, przez 6 godzin. Dalej pobrano wymazy za pomocą gąbek wstępnie zwilżonych  trzema bulionami transportowymi, bulionem Dey / Engley (D / E), bulionem Letheen i bulionem HiCap™, aby uzyskać próbki ze środowisk, które zawierały pozostałości środków dezynfekujących i niski poziom zestresowanych komórek Lm.

Wszystkie trzy buliony dały podobne wyniki, jeśli na powierzchnię nie zastosowano środka dezynfekującego lub zastosowano tylko niskie stężenie (400 ppm QAC). Przy zastosowaniu wysokiego stężenia QAC (8000 ppm) wymaz z bulionem Letheen nie miał już wystarczającej zdolności neutralizującej. Wyniki bulionu neutralizacyjnego D/E i bulionu HiCap były porównywalne.

Oba buliony wystarczająco zneutralizowały nawet wysoką dawkę QAC. Jednak bulion HiCap ma szereg zalet w porównaniu z bulionem D/E:

• stabilność przechowywania w temperaturze pokojowej,
• niealergiczny,
• brak składników pochodzenia zwierzęcego,
• uniwersalna kompatybilność z metodami testowymi.

 Każde medium ma swoje wady i zalety

HiCap™ jest wyjątkowy pod względem czasu przechowywania próbki aż do 72 godzin i ma doskonałe właściwości neutralizujące pozostałości użytych środków dezynfekujących. Badanie porównujące HiCap Neutralizing Broth™ i Neutralizing Buffer w celu utrzymania żywotności Listeria monocytogenes po pobraniu próbek z inokulowanych powierzchni ze stali nierdzewnej:

https://bioing.pl/wp-content/uploads/2022/02/Study-HiCap-v-NB-Listeria-Viability-from-Stainless.pdf

Producenci eksportujący do Stanów Zjednoczonych i podlegający przepisom FDA (głównie produkty mięsne) muszą używać bulionu Dey / Engley zgodnie z FDA BAM. Bulion D/E wykazuje bardzo dobre właściwości neutralizujące wobec stosowanych produktów dezynfekujących, jego wadą jest niestabilność podczas przechowywania (musi być przechowywany w lodówce) oraz zmiany pH. Najczęściej używanym w Europie medium do pobierania próbek i oznaczania Lm jest wciąż zbuforowana woda peptonowa. Nie ma ona natomiast właściwości neutralizujących wobec stosowanych środków dezynfekujących.

Kosher i halal

Producenci produkujący według standardów kosher i halal muszą używać zatwierdzonych produktów, ponieważ produkty do wymazów są używane bezpośrednio w produkcji. World Bioproducts przygotowuje nową gamę produktów, która będzie odpowiednia również dla tych producentów.

Materiał

Gąbki celulozowe są używane od ponad trzydziestu lat i są najczęściej stosowane. Jednak rozwój tworzyw sztucznych umożliwił stosowanie wyższej jakości materiałów na bazie poliuretanu.

Zaletą gąbek poliuretanowych są właściwości tego materiału. Poliuretan to zwarty materiał, miękki nawet po wyschnięciu i co najważniejsze nie strzępi się, nawet podczas pobierania próbek z szorstkich powierzchni oraz charakteryzuje się lepszym uwalnianiem mikroorganizmów.

Sucha czy zwilżona wymazówka

W niektórych rodzajach produkcji nie ma możliwości pracy ze zwilżonymi wymazówkami. Wymaz można natomiast bezpiecznie wykonać suchą gąbką poliuretanową, a następnie pobrane bakterie przechowywać w odpowiednim roztworze. Takie rozwiązanie oferuje wymazówka PUR-Blue DUO™.

Więcej próbek z jednego wymazu

W przypadku pobierania jednej próbki do analizy kilku patogenów nie należy dzielić próbek w laboratorium. Lepiej skorzystać z narzędzi opracowanych bezpośrednio w tym celu takich jak EZ-Reach™ Split Sampler. Umożliwiają sprawne pobranie próbki z jednego miejsca, a następnie podział wymazów na dwie próbki i ich oddzielny transport do laboratorium.

Błędne wyobrażenia na temat monitorowania środowiska produkcyjnego

„Metody monitoringu środowiska są uniwersalne“

Program monitorowania musi być zaprojektowany ze znajomością produktu, sprzętu i wykorzystania danych. Powinien opierać się na ryzyku zidentyfikowanym przez eksperta ds. bezpieczeństwa żywności. Wraz ze zmianą ryzyka i celów produkcyjnych program monitorowania również powinien się zmieniać i dostosowywać. Elementy programu można w razie potrzeby aktywować i dezaktywować. Punkty próbkowania można dodawać, zwiększać lub zmniejszać ich częstotliwość.

„Programy monitoringu środowiska dotyczą tylko patogenów“

Kompleksowy program monitoringu powinien obejmować następujące cztery programy:

• Monitoring powietrza – mikroorganizmy przedostają się z powietrza na produkt i urządzenia.
• Weryfikacja dezynfekcji – należy zweryfikować sprzęt czysty i zdezynfekowany.
• Podczas produkcji – próbki pobrane w trakcie produkcji pomagają ocenić jakość mikrobiologiczną.
• Patogeny – patogeny w ogóle nie powinny występować w środowisku produkcyjnym.

„Próbki powinno się pobierać ze wszystkiego“

Liczba unikalnych punktów pobierania próbek w zakładach produkcyjnych może być bardzo duża. Ważniejsze jest nadanie priorytetu punktom obarczonym wysokim ryzykiem niż próba pobrania próbki z każdego miejsca. Dobrą praktyką jest zidentyfikowanie krytycznych punktów kontrolnych (CCP). Niekiedy kontrola jednej operacji w danym punkcie krytycznym procesu produkcji
może wyeliminować lub zredukować do poziomów dopuszczalnych pozostałe zagrożenia.

„Produkcja żywności musi odbywać się w sterylnym środowisku“

Wymogiem jest, aby żywność była produkowana w czystym i higienicznym zakładzie. Oznacza to, że urządzenia produkcyjne muszą być wolne od nadmiernej ilości mikroorganizmów, które mogą pochodzić z pozostałości materiału organicznego z poprzednich dni produkcji. Czysty i higieniczny sprzęt powinien zawierać 

Najlepiej zacząć od zebrania danych za pomocą wymazów z miejsc, w których chcesz poznać zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Zadaj sobie pytanie: „Czy to miejsce jest pod mikrobiologiczną kontrolą?”. Zaangażuj eksperta ds. bezpieczeństwa żywności, który zna się na mikrobiologii żywności, aby pomógł Ci wdrożyć program monitoringu i interpretować dane. Najdroższe są te dane, które są gromadzone, ale nie są wykorzystywane.

World Bioproducts, LLC

Amerykańska firma zajmująca się produkcją innowacyjnych i wysokiej jakości produktów zapewniających bezpieczeństwo światowych dostaw żywności. Projektuje narzędzia wspierające program monitorowania środowiska w przemyśle spożywczym, które spełniają dzisiejsze wyjątkowe wyzwania związane z bezpieczeństwem żywności. World Bioproducts to wiodąca firma w tworzeniu rewolucyjnych produktów do pobierania próbek mikrobiologicznych oraz rozwiązań umożliwiających ich prostsze i wydajniejsze przetwarzanie.

Analiza w laboratorium

Po otrzymaniu i zarejestrowaniu próbki w laboratorium następuje pomnożenie i detekcja wybraną metodą. Na portalu foodfakty.pl wiele materiaów poświęconych jest listerii, kilkakrotnie wspominano o różnych metodach wykrywania i preferencjach ich doboru.

Wybór metody

Wybór metod diagnostycznych jest kluczowy dla wszystkich pobranych próbek, ale szczególnie dla próbek środowiskowych. Mogą być bardzo złożone i prawie zawsze nieznane. Bardzo często zawierają różne pozostałości żywności i innego materiału organicznego, różnorodną gamę nieznanych mikroorganizmów oraz pozostałości środków dezynfekujących. Wszystkie te składniki sprawiają, że analiza wymazów jest bardzo złożona. Każda metoda diagnostyczna musi być w stanie pracować z tymi zanieczyszczeniami i dostarczać solidnych i wiarygodnych danych. Metody diagnostyczne można zaprojektować tak, aby jak najszybciej osiągać wyniki, były łatwe do wdrożenia i minimalizowały koszty. Wiara w metodę diagnostyczną opiera się na zrozumieniu metody i problemów związanych z próbkami oraz zbieraniu i interpretacji tych wyników w czasie. Zaufanie do diagnostyki pozwala firmom za wczasu podejmować decyzje bez konieczności oczekiwania na wyniki wielodniowej hodowli drobnoustrojów.

Po co wykrywać żywe mikroorganizmy

Martwy patogen wykryty w zakładzie produkującym żywność nie stanowi zagrożenia dla bezpieczeństwa żywności. Interpretacja większości danych z wymazów środowiskowych jest taka, że wyniki podane przez laboratorium reprezentują żywe mikroorganizmy. W niektórych testach opartych na metodzie PCR możliwe jest wykrycie martwego DNA lub nieżywego antygenu z próbki, jeśli stężenie jest wysokie, a protokół przygotowania próbki nie powiedzie się. Procedury testowe mogą obejmować kroki pomagające zredukować te przypadki.

Wiele firm zdecydowało się na podjęcie działań naprawczych i zbadanie przyczyn fałszywie pozytywnych wyników. Fałszywie pozytywne wyniki mogą stanowić duży problem dla personelu kontroli jakości i prowadzić do frustracji. Zdolność diagnostyczna do dokładnego wykrywania żywych mikroorganizmów docelowych jest szczególnie ważna, gdy próbki są pobierane po dezynfekcji, gdy istnieje większe prawdopodobieństwo obecności martwych mikroorganizmów.

Wysokiej jakości wyniki już następnego dnia

System wykrywania patogenów Solus oferuje szereg opcji wykrywania Listeria spp., L. monocytogenes i Salmonella spp. w środowisku produkcyjnym, zarówno z wymazówek, jak i gąbek. Linia produktów Solus One do wykrywania Salmonelli i Listeria spp. wykorzystuje nowy skład roztworów do namnażania w połączeniu z czułymi testami ELISA drugiej generacji, które dostarczają wyniki już za 18, ewentualnie 24 godziny. Testy te mają specjalnie naniesione przeciwciała na powierzchni płytek dla maksymalnej wydajności wychwytywania antygenu. Ponadto oba te testy uzyskały certyfikat AOAC dla różnych powierzchni środowisk produkcyjnych.

Nasze tradycyjne dwustopniowe systemy namnażania mogą być korzystne, jeśli środowisko produkcyjne zawiera dużą ilość materiału organicznego lub hamującego, który mógłby zakłócać pomyślne wzbogacanie pierwotne. Oba rozwiązania mają przewagę nad metodami klasycznymi i molekularnymi.

Nasze testy ELISA są bardzo specyficzne, co daje pewność, że możesz podjąć decyzję dużo wcześniej niż przy metodzie hodowlanej. Ponadto zastosowanie systemu przesiewowego opartego na teście ELISA oznacza, że wykrywane są tylko żywe komórki, ponieważ niski poziom nieżywych antygenów nie daje wyniku pozytywnego.

Automatyzacja

Wszystkie testy Solus można wykonać na naszym automatycznym analizatorze Dynex DS2. Pozwala to na przetwarzanie prawie 600 próbek w ciągu jednej zmiany przez jednego operatora. Czas ten obejmuje potrzebny okres przestoju, podczas którego analityk może przygotować dodatkowe pomnożenia próbek i przetworzyć je przed badaniem w systemie Dynex. System może być również używany do rutynowej analizy próbek żywności pod kątem wszystkich wspomnianych patogenów, zapewniając kompletne i wydajne rozwiązanie dla wszystkich wymagań dotyczących monitorowania środowiska.

Perkin Elmer, Inc.

PerkinElmer to wiodący, globalny dostawca kompleksowych rozwiązań, które pomagają naukowcom i badaczom lepiej diagnozować choroby, odkrywać nowe i bardziej spersonalizowane leki, monitorować bezpieczeństwo i jakość naszej żywności oraz dążyć do doskonałości w zakresie analiz środowiskowych i stosowanych. Dzięki 85-letniemu dziedzictwu rozwoju nauki i innowacji na rzecz zdrowszego świata, nasz oddany zespół liczący ponad 16 000 pracowników, ściśle współpracuje z klientami komercyjnymi, rządowymi, akademickimi i medycznymi w celu dostarczania odczynników, testów, instrumentów, automatyzacji, informatyki i strategii usług, które przyspieszają i ułatwiają pracę oraz dostarczają praktycznych rozwiązań i wspierają łatwiejsze podejmowanie decyzji.

BIOING, sp. z o.o.

Firma handlowa i produkcyjna z dziesięcioletnią historią, będąca częścią międzynarodowej sieci dystrybucyjnej działającej na terenie Polski, Czech i Słowacji. Dla naszych międzynarodowych klientów dostarczamy nasze produkty i produkty naszych partnerów również do innych krajów europejskich.

Produkty wymienione w artykule dostarczamy na rynek polski w imieniu World Bioproducts, LLC oraz Perkin Elmer Inc., włącznie ze szkoleniami i kompleksową obsługą klienta.

LITERATURA

[1] Li et al. BMC Microbiology (2020) 20:333, https://bmcmicrobiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12866-020-02004-1

[2] Źródło własne World Bioproducts, LLC

[3] Źródło własne Perkin Elmer Inc.

[4] www.worldbioproducts.net

[5] www.perkinelmer.com

[6] www.bioing.pl