Zapewnienie jakości i bezpieczeństwa zdrowotnego żywności jest obecnie kluczowym aspektem zarówno dla producentów żywności, organów kontrolnych jak i konsumentów. Środki spożywcze pochodzenia roślinnego i zwierzęcego mogą stanowić zagrożenie dla ogólnego stanu i zdrowia człowieka, będąc wektorem wielu mikroorganizmów chorobotwórczych. Przedsiębiorstwa z sektora spożywczego odgrywają zatem kluczową rolę w zapewnieniu, że wytwarzane przez nich produkty żywnościowe są bezpieczne i niezanieczyszczone groźnymi dla zdrowia drobnoustrojami, takimi jak np.: Salmonella, Campylobacter, Listeria monocytogenes.

Według najnowszych danych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia (ang. WHO), każdego roku ok. 600 mln ludzi na całym świecie (prawie 1 na 10 osób) ulega zatruciu po spożyciu skażonej żywności, co przyczynia się aż do 420 tys. zgonów rocznie. Szacuje się, że w XXI wieku liczba chorób przenoszonych przez żywność wzrosła prawie dwukrotnie z powodu m.in.: intensyfikacji produkcji, globalizacji handlu żywnością, zmian klimatycznych oraz rosnącej liczby ludności. Sprawna diagnostyka i charakterystyka patogenów przenoszonych przez żywność ma zatem ogromne znaczenie nie tylko dla samego sektora spożywczego, ale także ze względu na ochronę zdrowia publicznego, a co za tym idzie, zapewnienia bezpieczeństwa konsumentów.

Powszechnie stosowane metody wykrywania patogenów

Drobnoustroje chorobotwórcze mogą być wykrywane w żywności na wiele sposobów, począwszy od tradycyjnych metod horyzontalnych, poprzez metody z wykorzystaniem przeciwciał (immunologiczne), aż po metody oparte na technologiach molekularnych (np. amplifikacja kwasów nukleinowych). Wymienione metody badawcze cechuje duże zróżnicowanie w czułości oraz czasochłonności, która w przypadku klasycznych metod hodowlanych na podłożach agarowych może wynieść nawet od 3 do 5 dni do uzyskania wyniku negatywnego.

W celu przeprowadzenia sprawnej i efektywnej diagnostyki patogenów w sektorze spożywczym niezbędne jest uzyskanie szybkich, dokładnych i wiarygodnych wyników.
Z tego powodu w ostatnich latach obserwuje się rosnące wykorzystanie rozwiązań detekcyjnych opartych na metodach biologii molekularnej. W porównaniu z innymi dostępnymi technikami analitycznymi, metody molekularne wyróżnia znacznie większa czułość i dokładność oraz, w zależności od badanego mikroorganizmu, skrócenie czasu do wydania wyniku negatywnego już od 12 do 24 godzin.

Początki diagnostyki molekularnej sięgają lat 80. XX wieku, wraz z odkryciem i wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), poprzez późniejsze opracowanie i stosowanie jej licznych modyfikacji (np. Real-Time PCR). Implementacja technik PCR była krokiem milowym w wielu dziedzinach nauki i znacząco przyczyniła się do rozwoju szybkich i czułych metod diagnostycznych polegających na amplifikacji oraz detekcji specyficznych odcinków DNA. Z biegiem lat upowszechnienie technik opartych na reakcji PCR znalazło swoje zastosowanie również w sektorze spożywczym. Szerokie wykorzystanie tych metod znacznie usprawniło i poprawiło czułość detekcji, m.in. patogenów w żywności, oraz skróciło czas do uzyskania wyniku analizy. Z drugiej strony, dynamiczna popularyzacja technik PCR w przemyśle żywnościowym uwidoczniła również kilka ograniczeń dotyczących samej metody, takich na przykład jak:

• konieczność używania kosztownych termocyklerów (zwłaszcza Real-Time PCR);
• ograniczona specyficzność i wydajność amplifikacji DNA;
• wrażliwość na liczne inhibitory znajdujące się w żywności oraz w środkach myjących i dezynfekcyjnych.

Obecnie techniki PCR są powszechnie stosowane w diagnostyce drobnoustrojów patogennych w żywności.  W ostatnich latach nastąpił intensywny rozwój nowych technologii opartych na amplifikacji i wykrywaniu specyficznych sekwencji DNA. Jedną z tych technik jest amplifikacja LAMP, która umożliwia uzyskanie szybkich i pewnych wyników analizy.

Metoda LAMP - Innowacja w molekularnych badaniach patogenów

Metoda LAMP (ang. Loop-Mediated Isothermal Amplification) jest postępową techniką molekularną, polegającą na izotermicznej reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych, która eliminuje konieczność wykorzystywania kosztownych termocyklerów. LAMP jest bowiem prostą i skuteczną metodą analityczną, która z wysoką czułością i specyficznością umożliwia przeprowadzenie szybkiej, wydajnej oraz niskonakładowej amplifikacji specyficznej sekwencji DNA patogenów w żywności. Metoda LAMP znacznie usprawnia amplifikację wybranych odcinków DNA oraz pokonuje liczne ograniczenia technik PCR z 5-ciu wartych do przybliżenia powodów:

• PROTOKOŁY BADAWCZE

W reakcji LAMP wykorzystywany jest jeden, uniwersalny protokół (profil) reakcji dla wszystkich patogenów w żywności, co umożliwia przeprowadzenie równoczesnych analiz wielu parametrów. W analizie PCR protokoły badawcze często różnią się pomiędzy badanymi drobnoustrojami, co utrudnia i wydłuża sprawną analizę.

• SPECYFICZNOŚĆ DO MATRYCOWEGO DNA PATOGENU

Metodę LAMP cechuje wysoka specyficzność, gdyż w reakcji wykorzystywanych jest od 4 do 6 starterów, zaś do amplifikacji materiału genetycznego dochodzi wyłącznie wówczas, gdy startery prawidłowo rozpoznają od 6 do 8 specyficznych sekwencji DNA badanego patogenu. W reakcji PCR stosowane są tylko 2 startery, rozpoznające 2 specyficzne regiony DNA mikroorganizmu.

• AMPLIFIKACJA DOCELOWEGO DNA

Reakcja LAMP przeprowadzana jest przez polimerazę Bst (izolowaną z Bacillus stearothermophilus), posiadającą zdolność do przemieszczania (wymiany) nici DNA, o aktywności niewrażliwej na znane inhibitory reakcji amplifikacji. Powszechne metody PCR wykorzystują inny enzym – polimerazę Taq – który jest mniej wydajny, za to bardziej podatny na działanie inhibitorów i hamowanie amplifikacji DNA.

• MECHANIZM REAKCJI

Amplifikacja LAMP przeprowadzana jest w sposób ciągły, w stałej i niezmiennej temperaturze (ok. 60^oC) przez polimerazę Bst. W przypadku metod PCR, wymagających cyklicznych etapów grzania i chłodzenia mieszaniny reakcyjnej oraz wielokrotnego przyłączania i odłączania polimerazy Taq od matrycy DNA, wydłużanie nici docelowego DNA jest ograniczone wyłącznie do długości trwania określonego cyklu, a co za tym idzie, podatne na interferencję.

• DETEKCJA PRODUKTÓW AMPLIFIKACJI

Jednym ze sposobów odczytu wyniku po amplifikacji DNA w metodzie LAMP jest wydajny pomiar bioluminescencji, której odczyt jest niewrażliwy na interferencję z badanej próbki. W wielu systemach PCR wykrycie produktów amplifikacji DNA dokonywane jest poprzez pomiar fluorescencji, która jest często zakłócana poprzez autofluorescencję, pochodzącą ze składników niektórych matryc żywnościowych lub komponentów pożywek mikrobiologicznych użytych do wzbogacenia próbki.

Obecny kierunek rozwoju

W ostatnim dziesięcioleciu w literaturze naukowej opublikowane zostały liczne artykuły wskazujące na ogromny potencjał i możliwości wykorzystania techniki LAMP do sprawnej i dokładnej diagnostyki drobnoustrojów chorobotwórczych w przemyśle żywnościowym. Metoda ta łączy ze sobą progresywną technologię amplifikacji DNA o wysokiej czułości i swoistości, wraz ze skróconym czasem niezbędnym do przeprowadzenia analizy.

Odzwierciedleniem potencjału technologii LAMP było opracowanie gotowych do użycia, komercyjnie dostępnych zestawów diagnostycznych w kierunku wykrywania wielu patogenów w sektorze spożywczym.

Metoda LAMP cieszy się coraz większym zainteresowaniem i jest z powodzeniem wdrażana w laboratoriach przyzakładowych oraz laboratoriach akredytowanych w skali globalnej, w tym również w krajach Europy. Efektem szerokiego uznania techniki amplifikacji LAMP jest oficjalne zatwierdzenie i rekomendowanie tej metody badawczej do rutynowej detekcji i identyfikacji patogenów (np. Salmonella, Listeria monocytogens), przez wiele niezależnych jednostek i organów kontrolnych, np. Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (ang. USDA - FSIS).   

W przypadku pojawienia się dodatkowych pytań, serdecznie zachęcamy do bezpośredniego kontaktu (e-mail: santon@mmm.com). Będzie Nam bardzo miło porozmawiać z Państwem osobiście i wspólnie omówić poruszone zagadnienia.