Zawartość białka w próbkach żywności, jest jednym z głównych parametrów oceny jakości danego produktu. Białko, jako podstawowy budulec tkanek ludzkiego organizmu, coraz częściej odgrywa kluczowe znaczenie, w doborze produktów spożywczych, które wchodzą w skład codziennej diety konsumentów. W ostatnich latach można zauważyć, zmianę struktury żywieniowej, na korzyść produktów wysokobiałkowych, co niesie za sobą potrzebę wykonywania większej ilości analiz, jak i dokładniejszej kontroli jakości próbek.

Począwszy od lat 50, aplikacje laboratoryjne do oznaczania zawartości białka całkowitego, opierały się na metodzie pośredniej, opartej na chemii mokrej czyli metodzie Kiejdahala. Metoda ta, została uznana za precyzyjną i dokładną, jednakże niesie za sobą szereg niedogodności w jej stosowaniu.

Proces analizy próbek metodą Kiejdahala, możemy podzielić na 3 etapy:

1. Analizowaną próbkę, mineralizuje się w temperaturze ok. 350 °C. Kluczowym odczynnikiem w tym procesie jest stężony kwas siarkowy oraz katalizator (np. siarczanem miedzi(II)). Węgiel i wodór w substancjach organicznych ulegają utlenieniu do dwutlenku węgla i wody, a azot reagujący z kwasem siarkowym tworzy nielotny siarczan amonu.
2. Następnie należy zalkalizować próbkę, poprzez dodanie wodorotlenku sodu. Powoduje to przekształcenie jonu amonowego w amoniak, a następnie podgrzana próbka poddana jest destylacji, w trakcie której amoniak przechodzi do formy gazowej.
3. Amoniak w kolejnym etapie, reaguje z dodanym kwasem solnym i poddany jest miareczkowaniu wodorotlenkiem sodu.

Obserwując procedurę wykonania analiz metodą Kiejdahala, możemy zauważyć, że wykorzystywany jest jako odczynnik kwas siarkowy, jak i inne szkodliwe odczynniki dla operatora. Wymaga ona również zaangażowania długiego czasu (kilku godzinny proces analizy), jak i zapewnienia znacznej ilości przestrzeni do wykonania analiz. Trzeba również zwrócić uwagę, iż Dyrektywa Komisji z dn. 4 czerwca 1993 r. zmieniająca załącznik I do trzeciej dyrektywy 72/199/EWG – „należy zmienić wyżej wymienioną metodę ze względu na zaawansowany postęp w nauce i technice” [1], a w szczególności zaś postanowienia Dyrektywy Rady 80/1107/EWG z dn. 27 listopada 1980 r. w sprawie ochrony pracowników narażonych na ryzyko związane z oddziaływaniem czynników chemicznych, fizycznych i biologicznych w czasie pracy [2].

Jednym z rozwiązań spełniających powyższe dyrektywy, jest wdrożenie automatycznej metody Dumasa w praktykach laboratoryjnych. Pierwsze analizatory azotu całkowitego, posiadały wyłącznie możliwość analizy próbek o masie kilku mg, jednakże wraz z rozwojem technologii, naważki wzrosły nawet do 0,5 g, zapewniając bardzo dobrą powtarzalność analiz. Metoda Dumasa polega na spaleniu próbki w celu oznaczenia zawartości azotu całkowitego, a następnie przelicznie wyniku w oparciu o dobór odpowiedniego współczynnika. Proces spalania próbki prowadzi się w temp. ok. 950 °C, zapewniając jej całkowite utlenienie. Produktem spalania są różne formy tlenków azotu, które podlegają redukcji do czystego azotu cząsteczkowego za pośrednictwem odczynnika zawierającego miedź. Ostatnim etapem jest oznaczenie zawartości azotu cząsteczkowego N₂, za pośrednictwem celi termoprzewodnościowej (TCD) z wykorzystaniem gazu nośnego helu lub argonu. Współczynniki konwersji/przeliczenia zawartości białek zależne są od widm aminokwasów typowych białek obecnych w danej klasie grupie żywności (tab. 1.).

Tabela 1. Współczynniki konwersji azotu na białko całkowite

Przykładem analizatorów do oznaczania próbek metodą Dumasa są rozwiązania firmy LECO – FP828 oraz FP928. Oba rozwiązania zapewniają duży poziom automatyzacji oznaczeń z wykorzystaniem 30 lub 100 pozycyjnego podajnika do próbek. Pomiary mogą być wykonane zarówno w atmosferze helu, jak i argonu. Ostatnie lata pokazały, iż użytkownicy metody Dumasa coraz częściej decydują się na oznaczenia próbek w atmosferze argonu, co znacznie obniża koszty prowadzonych analiz. W celu uzyskania prawidłowych wyników, każda metoda analityczna podlega kalibracji za pośrednictwem certyfikowanych wzorców chemicznych, np. EDTA lub glicyny. Na przestrzeni ostatnich lat, przygotowano wiele analiz, publikacji naukowych oraz materiałów, które porównały klasyczną metodę Kiejdahala oraz zautomatyzowaną metodę Dumasa.

Rys. Analizatory FP828 oraz FP928 firmy LECO

Poznaj rozwiązania LECO dla analiz białka

Tabela 2. Uśrednione wyniki analiz LECO dla azotu całkowitego dla różnych próbek żywności

Jak można zauważyć w tab. 2, wartości uzyskanych pomiarów dla metod Dumasa i Kiejdahala nie odbiegają od siebie, a wręcz prezentują te same wartości. Dla niektórych próbek metoda Kiejldahala wykazuje nieco niższe wartości niż metoda Dumasa, jednakże ogólna różnica dla typowych próbek żywności i paszy jest zwykle mniejsza niż 1-2%.

Podobne wnioski możemy wyciągnąć, analizując wyniki badań z tab. 3, uzyskane przez zespół analityczny Małopolskiego Centrum Monitoringu i Atestacji Żywności Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie pod kierownictwem prof. dr hab. Ewy Cieślik. Wyniki analiz przeprowadzone na analizatorze LECO TruSpec N wykazały, iż za pośrednictwem metody Dumasa otrzymujemy zbliżone i porównywalne wyniki do metody klasycznej Kiejdahala. Średnie wartości odzysku wahają się na poziomie od 98,9% do 100,5 %, w zależności od analizowanego materiału. Ilość azotu/białka we wszystkich próbkach była niemal identyczna.

Tabela 3. Zawartość białka oznaczona metodą Kiejdahla oraz Dumasa [3]

Tabela 4. Zbieżność metody Dumasa z normami

Reasumując, metoda Dumasa jest bardzo dokładną metodą, która pozwala na otrzymanie praktycznie identycznych wyników względem metody klasycznej Kiejdahala. Dumas, ze względu na krótki czas trwania analizy (około 4 minut vs kilka godzin w przypadku Kiejdahala), zmniejsza znacznie nakład pracy oraz czas wykonania analiz, przez co zapewnia niższe koszty oznaczeń. Niewątpliwą zaletą metody jest jej ekologiczny charakter oraz zapewnienie bezpieczeństwa osobom wykonującym analizy, poprzez redukcję lub całkowite usunięcie z metodyki odczynników chemicznych szkodliwych dla zdrowia. Metoda Dumasa jest uznaną metodą w wielu rozwiniętych krajach, zapewniając szybszy rozwój laboratoriów oraz dającą możliwości analizy większej ilości próbek w tym samym czasie.

Źródła:

[1] Dyrektywa Komisji 93/28/EWG z dnia 4 czerwca 1993 r. zmieniająca załącznik I do trzeciej dyrektywy 72/199/EWG ustalającej wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz.

[2] Dyrektywa Komisji 91/322/EWG z dnia 29 maja 1991 w sprawie ustanowienia indykatywnych wartości granicznych w wykonaniu dyrektywy Rady 80/1107/EWG w sprawie ochrony pracowników przed ryzykiem związanym z narażeniem na działanie czynników chemicznych, fizycznych i biologicznych w miejscu pracy.

[3] Adam Florkiewicz, Ewa Cieślik, Agnieszka Filipiak-Florkiewicz OZNACZANIE ZAWARTOŚCI AZOTU CAŁKOWITEGO W ŻYWNOŚCI – PORÓWNANIE METODY KIEJDAHLA I DUMASA  Małopolskie Centrum Monitoringu i Atestacji Żywności Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie Kierownik: prof. dr hab. E. Cieślik.