Bakterie Salmonella spp. to Gram-ujemne, względnie beztlenowe pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae, które choć wszechobecne, stanowią potencjalne niebezpieczeństwo dla konsumentów skażonej nimi żywności. Spożycie żywności zanieczyszczonej bakteriami Salmonella może powodować pojawienie się objawów zatrucia takich jak: bóle brzucha, nudności, wymioty, biegunka, gorączka i odwodnienie. Jest to szczególnie niebezpieczne dla dzieci, osób w podeszłym wieku i osób z obniżoną odpornością. Może bowiem dojść do uogólnionego zakażenia organizmu i rozwoju posocznicy. Szacunkowy czas potrzebny na wykrycie obecności bakterii Salmonella spp. w próbce żywności z użyciem tradycyjnej procedury może przekraczać nawet 7 dni. Tak długi tok postępowania generuje wysokie koszty dla producentów żywności ze względu na konieczność wycofania określonych partii produktów z rynku w przypadku stwierdzenia obecności tego patogenu, a także często straty wizerunkowe dla firmy.

Opracowanie nowych metod wykrywania bakterii Salmonella spp. opartych na analizie kwasów nukleinowych, takich jak metoda łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR, qPCR), czy też amplifikacja w pętli izotermicznej LAMP (ang. Loop-mediated Iso-thermal Amplification, amplifikacja w warunkach izotermicznych) pozwala w znacznym stopniu skrócić całkowity czas analizy. W konsekwencji metody te stają się coraz bardziej popularne w wykrywaniu źródeł i dróg zanieczyszczenia żywności patogenami.

Łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) jest skutecznym narzędziem w detekcji bakterii Salmonella spp., gdyż uzyskany wynik jest obiektywny i niezależny od stanu fizjologicznego mikroorganizmów (rys. 1).

Rys. 1. Porównanie metody hodowlanej i technik PCR w detekcji patogenów żywności

Analiza kwasów nukleinowych zarówno bezpośrednio w próbkach żywności, jak i w nieselektywnie namnażanych hodowlach umożliwia nie tylko wykrywanie żywych, aktywnych metabolicznie i zdolnych do wirulencji komórek patogenów, ale również komórek drobnoustrojów znajdujących się w stadium VBNC (ang. ang. Viable But Not Culturable, żywe lecz nie dające się hodować w warunkach laboratoryjnych), w stanie subletalnym, czy też komórek martwych, a w skrajnym przypadku nawet wyłącznie samych kwasów nukleinowych uwolnionych do środowiska po lizie komórek. Stanowi to znaczącą przewagę metod biologii molekularnej nad klasycznymi metodami hodowlanymi, zwłaszcza gdy analizie poddawana jest żywność charakteryzująca się niską aktywnością wody.

Klasyczne metody wykrywania Salmonella spp.

Rutynowa detekcja bakterii Salmonella spp. opiera się na zastosowaniu wieloetapowej, czasochłonnej i materiałochłonnej metody opisanej w normie PN-EN ISO 6579-1:2017. „Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella. Część 1: Wykrywanie Salmonella spp.”.

Metoda ta obejmuje następujące etapy: przednamnażanie w zbuforowanej wodzie peptonowej, namnażanie selektywne w pożywkach bulionowych Rappaport-Vassiladis z soją (RVS) i Muller-Kaufmann z tetrationianem nowobiocyny (MKTTn), następnie etap izolacji na pożywkę selektywną XLD oraz potwierdzenia. Ostatni etap prowadzony jest w oparciu o cechy biochemiczne wyizolowanych podejrzanych szczepów, takie jak fermentacja glukozy, laktozy i sacharozy, wytwarzanie siarkowodoru, hydroliza mocznika, zdolność do dekarboksylacji L-lizyny, oraz opcjonalnie ocena aktywności β-galaktozydazy, czy tworzenie indolu z tryptofanu. Szczepy wykazujące typowe reakcje biochemiczne dla Salmonella wymagają dodatkowo przeprowadzenia badań na obecność antygenów O i H, a tam gdzie spodziewana jest obecność Salmonella Typhi, również antygenu Vi. Badanie te prowadzone są metodą aglutynacji szkiełkowej z wykorzystaniem poliwalentnej surowicy odpornościowej.

Przeprowadzenie wszystkich niezbędnych etapów wykrywania Salmonella jest bardzo czasochłonne. Wraz z badaniami serologicznymi wynik otrzymuje się dopiero po 7 dniach.

W praktyce laboratoryjnej prowadzonej w zakładach przemysłowych może to stanowić wyzwanie logistyczne, a nawet być utrudnione, zwłaszcza, przy konieczności równoczesnej inkubacji wielu próbek poddawanych wieloetapowej analizie jaką jest wykrywanie Salmonella spp. w klasycznym podejściu. W przypadku produktów o krótkim terminie ważności lub w przypadku bardzo dużej liczby analiz, wykorzystywanie tylko i wyłącznie klasycznych procedur badawczych w laboratorium przyzakładowym jest więc utrudnione i kosztochłonne. Z tego powodu dąży się do opracowania nowych metod, które pozwalają na uzyskanie wiarygodnego wyniki w krótkim czasie. Jedną z metod jest zastosowanie techniki ELFA (ang. Enzyme Linked Fluorescent Assay, metoda enzymoimmunofluorescencyjna) z wykorzystaniem systemu Vidas (bioMérieux), która umożliwia skrócenie czasu analizy i uzyskanie wyniku już po 3 dniach.

W przypadku techniki qPCR całkowity czas oznaczenia pozwalający wykluczyć lub potwierdzić obecność bakterii Salmonella w badanej próbce żywności można zminimalizować do ok. 24 godzin (również dla wyniku otrzymywanego w procedurze poprzedzanej nieselektywnym namnażaniem drobnoustrojów). Firma bioMérieux deklaruje możliwość wykrycia bakterii z użyciem GENE-UP® QUANT Salmonella w czasie do 4 godzin od momentu rozpoczęcia analizy w momencie rezygnacji z etapu przednamnażania [bioMérieux, 2021].

Technika łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym

Przydatność techniki qPCR w detekcji patogenów, w tym bakterii z rodzaju Salmonella, występujących w zróżnicowanych matrycach żywnościowych została wielokrotnie udowodniona. Ogólny schemat przebiegu analizy próbki żywności techniką qPCR przedstawia rys. 2.

Rys. 2. Ogólny schemat przebiegu detekcji bakterii Salmonella w żywności

Aby bakterie Salmonella spp. mogły być wykryte w żywności, w pierwszej kolejności należy odważyć odpowiednią ilość próby (podobnie jak w klasycznym podejściu może to być 25 gramów). Pobraną próbkę należy poddać nieselektywnemu przednamnażaniu w zbuforowanej wodzie peptonowej (37°C, przez kilka – kilkanaście godzin), a następnie ekstrakcji DNA. Możliwe jest również uwolnienie DNA bezpośrednio z matrycy żywności za pomocą buforu lizującego z pominięciem etapu namnażania. Kolejną czynnością jest przygotowanie reakcji PCR z użyciem odpowiedniej polimerazy i specyficznych starterów pozwalających na detekcję genu lub genów charakterystycznych dla bakterii Salmonella spp. W technologii real-time PCR, podobnie jak w „tradycyjnej” łańcuchowej reakcji polimerazy, wykrywa się więc DNA poszukiwanego drobnoustroju (konkretnych genów markerowych charakterystycznych dla danego gatunku), a główna różnica pomiędzy obiema metodami dotyczy sposobu odczytu i wizualizacji uzyskiwanego wyniku. Odczyt wyników w postaci sygnału fluorescencji emitowanego przez tworzone kolejne kopie produktów amplifikacji rejestrowanego w technice qPCR ma miejsce bezpośrednio w trakcie przebiegu reakcji a nie dopiero po jej zakończeniu. Oznacza to, że możemy pominąć etap elektroforetycznego rozdziału produktów amplifikacji, a tym samym skrócić czas analizy. Otrzymywany w metodzie qPCR wynik prezentowany jest na ekranie komputera w przejrzysty graficznie sposób, co ułatwia jego interpretację (Misiewicz i Goncarzewicz, 2013).

Jak w przypadku każdej metody analitycznej, również w real-time PCR należy mieć świadomość, że pewne czynniki mają kluczowe znaczenie dla uzyskania prawidłowego wyniku. Takim istotnym czynnikiem jest skład chemiczny żywności, gdyż niektóre substancje mogą hamować reakcję PCR, co może skutkować otrzymaniem wyników fałszywie ujemnych. Inhibitorami reakcji PCR występującymi w żywności mogą być m.in. polifenole, polisacharydy, w tym również pektyny i glikogen, tłuszcze, etanol, a ponadto sole takie jak chlorek potasu, chlorek sodu, jak również jony wapnia, ale także proteazy. W przypadku ryzyka wystąpienia zahamowania reakcji PCR, należy zastosować odpowiedni dostępny komercyjnie zestaw do usuwania inhibitorów łańcuchowej reakcji polimerazy lub zmodyfikować protokół izolacji kwasów nukleinowych, w taki sposób, aby podnieść jakość otrzymywanych preparatów poprzez eliminację inhibitorów (Jaroszewska i wsp., 2014; Schrader i wsp., 2012).

Aby zapewnić prawidłowość uzyskiwanych wyników zaleca się, aby każdorazowo badać temperaturę topnienia otrzymywanego produktu reakcji PCR oraz przyjrzeć się przebiegowi krzywej reakcji. Odpowiedni przebieg krzywej obrazującej sygnał fluorescencji, krzywej topnienia oraz brak dodatkowych pików o temperaturze topnienia odmiennej niż dla właściwego produktu na krzywej pokazującej tzw. „piki topnienia” umożliwia bowiem określenie specyficzności uzyskanego amplikonu. Możliwe jest również zastosowanie sond FRET (ang. fluorescent resonnance energy transfer), równocześnie w każdej badanej serii próbek, należy równolegle przeprowadzić reakcję PCR będące pozytywną (z matrycą DNA wyizolowanego z bakterii Salmonella spp.) i negatywną (bez matrycy DNA, którą zastępuję się wodą wolną od DNAz i RNAz) kontrolą procesu (Amplicon, 2020). Ponadto zalecane jest zastosowanie odpowiedniej kontroli wewnętrznej reakcji (ang. Internal Amplification Control; IAC), w postaci amplifikacji fragmentu kontrolnego (niespecyficznego dla wykrywanego patogenu) równolegle z sekwencją docelową, która jest poszukiwana. Przy prawidłowym przebiegu reakcji PCR sekwencja niespecyficzna powinna być powielana również w próbówkach, w których sekwencja genu markerowego nie występuje.

W skład mieszaniny reakcyjnej PCR wchodzą startery umożliwiające wykrywanie genów markerowych bakterii Salmonella spp. Przykładowe geny wykrywane w reakcji qPCR to: invA, który koduje białko wirulencji – proteazę uszkadzającą nabłonek jelita, bipA – kodujący białko wydłużające GTP, czy też iagA, który koduje białko wirulencji (Calvó i wsp., 2008, Chua i Bhagwat, 2009).

Na rys. 3 i 4 pokazano odpowiednio przebieg przykładowych krzywych topnienia produktów reakcji real-time PCR wykrywającej gen invA oraz pików krzywej topnienia. Badaną w Instytucie Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej próbką żywności był sezam biały, a procedura obejmowała etap przednamnażania drobnoustrojów przez 12 godzin, a następnie ekstrakcję metagenomowego DNA bakteryjnego z użyciem komercyjnego zestawu opartego o złoża krzemionkowe. Kolorem niebieskim oznaczono przebieg krzywej dla próbki negatywnej (DNA zastąpione wodą), zaś kolorem czerwonym – próbki kontrolnej pozytywnej (DNA szczepu Salmonella Enteritidis 34SK). Dla oznaczania przebiegu krzywej dla analizowanego produktu zastosowano kolor zielony.

Rys. 3. Przebieg przykładowej krzywej topnienia

Rys. 4. Piki topnienia dla przykładowych próbek poddanych analizie qPCR

Metoda qPCR zapewnia wysoką wydajność wykrywania patogenów w żywności, a otrzymywane wyniki są obiektywne i wiarygodne. Powoduje to intensyfikację prac nad tworzeniem aktów normatywnych wprowadzających stosowanie tej metody do rutynowej kontroli żywności. Obecnie procedowany jest projekt normy (ISO/DTS 6579-4) opisującej użycie metody PCR do identyfikacji jednofazowych szczepów Salmonella Typhimurium o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-. Dotychczas opublikowano normy opisujące wykrywanie określonych patogenów w żywności z zastosowaniem techniki real-time RT-PCR dotyczące przykładowo detekcji norowirusa i wirusa zapalenia wątroby typu A – HAV (PN-EN ISO 15216-1:2017 i 15216-2:2017), jak również techniki qPCR w detekcji Clostridium botulinum produkujących neurotoksyny typu A, B, E i F (ISO/TS 17919:2013), czy też serotypów Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) O157, O111, O26, O103 i O145 (ISO/TS 13136:2012), a także patogennych Yersinia enterocolitica i Yersinia pseudotuberculosis (ISO/TS 18867:2015). Natomiast normy ISO 20836:2021, PN-EN ISO 22118:2011 i PN-EN ISO 22119:2011 precyzują wymagania dotyczące techniki PCR i real-time PCR w detekcji i określaniu liczebności patogenów występujących w żywności.

Komercyjne zestawy do wykrywania Salmonella spp. techniką qPCR

W celu wykrycia bakterii Salmonella spp. techniką qPCR, na polskim rynku, dostępnych jest wiele gotowych zestawów odczynników. Poniżej opisano przykładowe komercyjne rozwiązania jakie mogą zostać użyte.

W przypadku procedur zastosowanych w zestawie GENE-UP® firmy bioMérieux, sugeruje się, aby czas inkubacji prób na etapie nieselektywnego namnażania w zbuforowanej wodzie peptonowej trwał od 8 do maksymalnie 24 godzin. Po namnożeniu mikroorganizmów, następnym etapem jest przeprowadzenie lizy komórek bakteryjnych, w uproszczony sposób. Według informacji producenta, ekstrakcja DNA prowadzona jest w formie lizy mechanicznej i opiera się na odczynnikach gotowych do użycia bez konieczności ich wcześniejszego przygotowania. Cały proces uzyskania kwasów nukleinowych trwa około 5 minut, przy czym nie wymaga dodawania jakiegokolwiek odczynnika ani zmiany temperatury. Udział użytkownika zestawu na tym etapie został zredukowany jedynie do przeniesienia próbki z pożywki namnażającej do probówki lizującej, co ma ułatwić pracę oraz zminimalizować ryzyko przypadkowej kontaminacji próbek. Dodatkowo ryzyko to jest minimalizowane poprzez użycie dostarczonych próbówek lizujących, których zamknięcie należy przebić tipsem bez ich otwierania. W celu ograniczenia możliwości pojawienia się błędnych wyników analizy, w swoim zestawie firma bioMérieux wykorzystuje sondy FRET (Gąsior, 2020).

Zestaw genesig® Real-Time PCR (Primerdesign™) również opiera się na użyciu sondy TaqMan®. Hybrydyzacja starterów w reakcji PCR ma miejsce do genu invA. Zestaw zawiera również matrycę DNA będącą wewnętrzną kontrolą pozytywną. Można to wykorzystać do wygenerowania standardowej krzywej pomocnej w analizie ilościowej (GENESIG Primerdesign, 2018).

Kolejny zestaw diagnostyczny to MicroSEQ™ Salmonella spp. Detection Kit (Applied Biosystems™) również zawiera sondę TaqMan® do wykrywania amplifikowanej sekwencji. Użyto polimerazy typu Hot start, wprowadzony został także barwnik pasywny ROX (6-karboksy-N,N,N',N'-tetrametylorodamina), wymagany przy użyciu niektórych typów termocyklerów. Wyniki można uzyskać w czasie krótszym niż 3 godziny po przednamnażaniu próbki (łącznie procedura trwa mniej niż 19 godzin). Według producenta testu możliwe jest wykrycie 1-3 jednostek tworzących kolonie w 25 g żywności. Zestaw umożliwia także eliminację wyników fałszywie ujemnych za pomocą wewnętrznej kontroli (Applied Biosystems, 2017).

Ostatni z omawianych zestawów – AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) jest testem pozwalającym potwierdzić lub wykluczyć obecność DNA Salmonella spp. w próbkach żywności, tkanek i kale kręgowców. Podobnie, jak w przypadku poprzednich zestawów, detekcja obecności genu markerowego następuje dzięki sondzie typu TaqMan®, zastosowano także system kontroli wewnętrznej, który stanowi potwierdzenie prawidłowego przebiegu procesu ekstrakcji DNA i reakcji real-time PCR (Amplicon, 2020).

Podsumowanie

Metody molekularne, w tym qPCR mają wiele zalet w porównaniu z tradycyjną procedurą wykrywania patogenów w żywności. Łańcuchowa reakcja polimerazy przebiega w termocyklerze i jest monitorowana w czasie rzeczywistym przy wykorzystaniu systemu detekcji poziomu fluorescencji. Metodę qPCR charakteryzuje wysoka specyficzność i wrażliwość (niski próg detekcji). Rekomendowane jest rozpoczęcie procedury analitycznej od nieselektywnego przednamnażania drobnoustrojów w próbce żywności. Niewątpliwie jednak największe znaczenie stosowania tej metody w porównaniu do metod hodowlanych mają korzyści wynikające ze skróconego do minimum czasu potrzebnego na analizę próbek żywności. Nie bez znaczenia są również jej prostota oraz możliwości prowadzenia analizy wielu próbek równocześnie, przy niewielkim nakładzie materiałów i powierzchni w porównaniu do metody hodowlanej. W warunkach przemysłowych analiza prowadzona jest z użyciem odczynników dostępnych w postaci gotowych do użycia zestawów, co znacząco upraszcza wykonanie procedury i interpretację wyników.

Literatura:

[1] Amlicon. AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR). Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzaju Salmonella techniką Real Time PCR, 2020. Dostęp online: https://admin.amplicon.pl/uploads/www-pl/BAC01%20-%20PL%202.0.pdf.

[2] Applied Biosystems. MicroSEQ™ Salmonella spp. Detection Kit, 2017. Dostęp online: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4403930

[3] bioMérieux. When accuracy counts, get a real number. Quickly quantify Salmonella, 2021. Dostęp online: https://www.biomerieux-industry.com/sites/default/files/2021-12/GENE-UP%C2%AE%20QUANT%20Salmonella%20%28Sell%20Sheet%29.pdf

[4] Calvó L., Martínez-Planells A., Pardos-Bosch J. A new real-time pcr assay for the specific detection of Salmonella spp. targeting the bipA Gene. Food Analytical Methods, 2008, 1:236–242.

[5] Chua T., Bhagwat A. A Rapid and Simple DNA Extraction Procedure to Detect Salmonella spp. and Listeria monocytogenes from Fresh Produce Using Real-time PCR. Food Anal. Methods, 2009, 2: 96–101.

[6] Gąsior A., Wykrywanie Salmonella spp. w produktach żywnościowych - metody bioMérieux. 2020. Dostęp online: https://foodfakty.pl/wykrywanie-salmonella-spp-w-produktach-zywnosciowych-metody-biomerieux

[7] GENESIG Primerdesign. Quantification of All pathogenic Salmonella species genomes. genesig Advanced kit handbook HB10.03.11, 2018. Dostęp online: https://dnagdansk.com/wp-content/uploads/2021/06/salmonella_inva.pdf

[8] ISO 20836:2021. Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of microorganisms — Thermal performance testing of thermal cyclers

[9] ISO/DTS 6579-4 (under development). Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 4: Identification of monophasic Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:-) by polymerase chain reaction (PCR)

[10] ISO/TS 13136:2012. Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Detection of botulinum type A, B, E and F neurotoxin-producing clostridia

[11] ISO/TS 18867:2015. Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis

[12] Jaroszewska E., Pietracha D., Misiewicz A. Patogeny człowieka w żywności pochodzenia roślinnego – wady i zalety zastosowania techniki real-time PCR do ich wykrywania. Postępy Nauki i Technologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, 2014 69(1): 44-54.

[13] Misiewicz A., Goncerzewicz A. Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi w produktach żywnościowych. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 2013, 573: 3–11.

[14] ISO 20837:2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Requirements for sample preparation for qualitative detection

[15] PN-EN ISO 6579-1:2017. „Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella. Część 1: Wykrywanie Salmonella spp.”

[16] PN-EN ISO 15216-1:2017. Mikrobiologia łańcucha żywnościowego -- Metoda horyzontalna do określenia obecności wirusa zapalenia wątroby typu A i norowirusa przy użyciu real-time RT-PCR -- Część 1: Metoda ilościowa

[17] PN-EN ISO 15216-2:2017. Mikrobiologia łańcucha żywnościowego -- Metoda horyzontalna do określenia obecności wirusa zapalenia wątroby typu A i norowirusa przy użyciu real-time RT-PCR -- Część 2: Metoda wykrywania

[18] PN-EN ISO 22118:2011. Mikrobiologia żywności i pasz -- Reakcja łańcuchowa polimerazy [PCR] do wykrywania drobnoustrojów chorobotwórczych w żywności -- Charakterystyka molekularnych metod wykrywania

[19] PN-EN ISO 22119:2011. Mikrobiologia żywności i pasz -- Reakcja łańcuchowa polimerazy [PCR] do wykrywania drobnoustrojów chorobotwórczych w żywności -- Ogólne wymagania i definicje

[20] Schrader C., Schielke A., Ellerbroek L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology, 2012, 113: 1014-1026.