Salmonella to rodzaj względnie beztlenowych, Gram-ujemnych bakterii należących do rodziny Enterobacteriacae, które zwykle posiadają peritrichalne orzęsienie i wykazują zdolność ruchu. Salmonella spp. obejmuje około 2541 różnych serotypów, z których każdy jest potencjalnie niebezpieczny dla człowieka. Ich wszechobecność w środowisku sprawia, że są głównym czynnikiem powodującym choroby układu pokarmowego u ludzi. Z tego względu, już od wielu lat na całym świecie wprowadzane są programy kontrolujące procesy produkcji, a także dystrybucji żywności, które mają na celu wykrywanie obecności bakterii Salmonella spp. i zapewnienie bezpieczeństwa produktów żywnościowych. Do rodzaju Salmonella zaliczane są obecnie dwa gatunki tj. Salmonella enterica (2519 seroptypów) oraz Salmonella bongori (22 serotypy). Duża liczba serotypów wymusza wprowadzenie odpowiedniej nomenklatury np. pełna nazwa Salmonella typhimurium brzmi Salmonella enterica subsp. enterica serowar Typhymurium. Salmonella Typhimurium lub S. Typhimurium to akceptowalna krótsza nazwa. Pełna serologiczna charakterystyka szczepów Salmonella obejmuje obecność lipopolisacharydowego, powierzchniowego antygenu (O), antygenu rzęskowego (H) oraz otoczkowego (Vi) występującego tylko u S. Typhi, S. Paratyphi C i S oraz S. Dublin X.
Bakterie z rodzaju Salmonella są najczęstszą przyczyną zatruć pokarmowych u ludzi. Choroba wywoływana przez pałeczki bakterii z rodzaju Salmonella to salmonelloza. Zakażenia mogą przebiegać pod różnymi postaciami klinicznymi o różnym stopniu ciężkości. Najczęściej spotykana jest postać żołądkowo-jelitowa, z okresem wylęgania wynoszącym zwykle od 8 do 72 godzin, w zależności od dawki infekcyjnej. Początek choroby może być bardzo gwałtowny, z bólami brzucha, wymiotami czy biegunką. Objawy mają różne nasilenie, utrzymują się kilka dni i od początku choroby występują stany podgorączkowe lub gorączka, która zwykle nie przekracza 39℃. U części chorych może dojść do penetracji bariery jelita, co w konsekwencji może doprowadzić do postaci narządowej salmonellozy (zapalenia płuc, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych czy innych) lub spowodować sepsę. Każdego roku z powodu salmonellozy umiera około 150 000 osób na całym świecie.
Salmonella spp jest wszechobecna. Rezerwuarami pałeczek bakterii są zarówno ssaki, jak i ptaki, ale również gady, płazy czy owady. Infekcja ludzi może nastąpić bezpośrednio, jak również pośrednio, np. poprzez zanieczyszczenie odchodami wody wykorzystywanej do podlewania roślin. W zależności od kraju występowanie bakterii rodzaju Salmonella u zwierząt hodowlanych jest bardzo różne i waha się od 10,5% do 62,5% u drobiu i od 0,8% do 91,8% w przypadku wieprzowiny. Główne źródła infekcji u ludzi to przede wszystkim jaja oraz drób, owoce i warzywa, mleko oraz produkty mleczne, a także ryby i skorupiaki.
Z uwagi na powszechność występowania bakterii niezmiernie ważne jest, aby już na etapie produkcji żywności przeprowadzać szczegółowe kontrole, które ograniczą ryzyko zanieczyszczenia produktu. Niestety nie jest to proste zadanie, ponieważ pałeczki z rodzaju Salmonella są bakteriami dobrze adaptującymi się do niekorzystnych warunków środowiskowych. Najlepszy wzrost wykazują w temperaturze 37℃ jednak charakteryzuje je także bardzo duża zdolność przeżywania i adaptacji do innych temperatur (od 2℃ do nawet 54℃). W procesie produkcji żywności często stosowanym zabiegiem poprawiającym jakość produktu jest pakowanie w atmosferze ochronnej np. CO2. Wzrost bakterii w warunkach wysokiego stężenia CO2 (60–80% obj/obj) jest zahamowany, jednak uszkodzenie opakowania i spadek poziomu CO2, może powodować ryzyko wzrostu i zakażenia bakterią. Salmonella może wzrastać w pH od 4,0 do 9,5, a optimum wzrostu ma miejsce przy pH od 6,5 do 7,5. Również aktywność wody ma wpływ na wzrost bakterii, ale dopiero jej spadek poniżej wartości 0,93 powoduje zahamowanie wzrostu. Badania nad odpornością cieplną Salmonella pokazały, iż redukcja wzrostu o jeden logarytm przy temperaturze 57,2℃ następowała po 40–55 minutach, podczas gdy w przypadku substancji o niskiej aktywności wody aw=0,9 redukcja taka następowała już po upływie 2–8 minut. Z tego powodu w przypadku żywności nawet skompilowane procesy technologiczne mogą nie wyeliminować całkowicie obecności niniejszej bakterii.
Wykrywanie Salmonella spp.
Standardowa metoda wykrywania Salmonella spp. obejmuje pięć podstawowych etapów: wstępne namnażanie, selektywne namnażanie, posiew na podłoża agarowe, identyfikacja biochemiczna oraz potwierdzenie serologiczne. Przeprowadzenie tych pięciu etapów gwarantuje otrzymanie wiarygodnego wyniku. Jednakże również bardzo ważną informacją jest sposób pobierania prób np. pobranie 10 prób 25 gramowych z różnych przypadkowych miejsc danej serii produktu zapewnia bardziej wiarygodny wynik niż jedna próba o wadze 250 gram.
Wstępne namnażanie w zbuforowanej wodzie peptonowej przez 18–24 godziny w temperaturze 35–37℃ powoduje wzrost pałeczek rodzaju Salmonella do poziomu 104 czy 107na ml pożywki, jednakże przekroczenie temperatury inkubacji może powodować zahamowanie wzrostu bakterii, które mogą być w złym stanie fizjologicznym, na skutek wytwarzania białek szoku termicznego. W konsekwencji przekroczenie temperatury inkubacji może powodować uzyskanie wyników fałszywie ujemnych. Następnym etapem jest 18–24 godzinna inkubacja na podłożach selektywnych, takich jak np. Rappaport-Vasiliadis (RV) czy Muller-Kauffmann (MKKTn) często w podniesionej temperaturze do 41–43℃, aby jeszcze bardziej zwiększyć selektywność podłoży. Wieloletnie prowadzone badania nad skutecznością wykrywania Salmonella doprowadziły do wielu interesujących wniosków np. wykorzystanie podłoża seleninowo-cysteinowego do badania żywności powodowało uzyskiwanie fałszywie negatywnych wyników w około 4,3% przypadków, co doprowadziło do zaniechania tej metody w przypadku badania żywności. Również jakość stosowanych podłoży mikrobiologicznych ma ogromne znaczenie dla ostatecznego wyniku. Każda seria pożywek powinna zostać dokładnie skontrolowana przed wykorzystaniem w laboratorium. Bardzo często w zakładach przemysłowych z uwagi na ogromną liczbę prób nie ma możliwości dokładnego sprawdzenia pożywki na szczepach kontrolnych po jej przygotowaniu. Pracownicy laboratoriów przemysłowych opierają się głównie na certyfikatach dostarczonych przez producenta. Niestety nawet te same pożywki wytwarzane przez różnych producentów znaczącą różnią się właściwościami od siebie. W skrajnych przypadkach różnica w żyzności podłoża może osiągać nawet kilkadziesiąt procent. Również stosowanie podłoży wykonywanych własnoręcznie powoduje powstawianie szeregu wątpliwości: Czy naważka była wykonana prawidłowo? Czy prawidłowo ustalono pH? Czy prawidłowo działał autoklaw i nie przekroczył zaprogramowanych temperatur? Czy dodano wszystkie składniki/suplementy?
Z ww. powodów firma bioMérieux jako najważniejszy element swoich produktów uznaje – JAKOŚĆ. Wszystkie rodzaje pożywek produkowanych w firmie bioMérieux poddane są rygorystycznej kontroli, która często jest bardziej restrykcyjna niż ta przedstawiona w normie ISO 11133. Dzięki temu użytkownik ma pewność, że uzyskanie wyniku ujemnego oznacza brak obecności bakterii rodzaju Salmonella. Kierownik laboratorium wydający wynik ujemny zawsze może być pewien, iż uzyskany wynik jest prawidłowy.
Stosowanie żmudnych i czasochłonnych metod opisanych w normie PN-EN ISO 6579-1:2017 w zakładach przemysłowych czasami jest bardzo utrudnione. W przypadku produktów o krótkim terminie ważności lub w przypadku bardzo dużej liczby analiz, wykorzystywanie tylko i wyłącznie klasycznych procedur badawczych jest niemożliwe. Z tego względu firma bioMérieux od lat przeznacza znaczące środki na działania zespołu badawczo-rozwojowego, aby wprowadzić na rynek metody alternatywne, które będą szybsze, łatwiejsze, bardziej wydajne, ale tak samo specyficzne i wiarygodne jak metody klasyczne.
Po latach doświadczeń, obecnie w ofercie firmy bioMérieux znajdują się trzy alternatywne metody dostosowane dla każdego rodzaju laboratorium i potrzeb.
SALMA™ ONE DAY
Pierwsze rozwiązanie jakie proponuje firma bioMérieux oparte jest na podłożach mikrobiologicznych. Jest to rozwiązanie przeznaczone dla mniejszych laboratoriów, które nie mają możliwości inwestycji w specjalistyczną aparaturę badawczą. Podłoże przeznaczone jest do wykrywania bakterii Salmonella spp. w próbkach produktów spożywczych, pasz dla zwierząt, próbkach mleka w proszku i składników używanych do produkcji mleka w proszku dla noworodków, a także próbach środowiskowych z obszarów produkcji innych niż próbki produkcji pierwotnej. Podłoże to można używać również jako drugie podłoże w ramach standardowej metody wykrywania bakterii Salmonell spp.
Zastosowanie procedury SALMA™ ONE DAY pozwala na uzyskanie wyniku w czasie 48 godzin, zatem zdecydowanie szybciej niż w przypadku metody klasycznej. Całość metody opera się na dwóch etapach. Pierwszym etapem jest namnażanie bakterii Salmonella w zbuforowanej wodzie peptonowej z dodatkiem specjalnego suplementu. Suplement ten przygotowany jest w formie tabletki, którą bezpośrednio dodaje się do pożywki z naważoną próbką, a następnie całość należy inkubować przez 16 do 24 godzin w temperaturze 41,5℃. Drugim etapem jest wykonanie posiewu na specjalnym podłożu agarowym SALMA™ i inkubacja w temperaturze 37℃, w czasie 21–27 godzin. Zasada działania podłoża opiera się na zastosowaniu substratu chromogennego (aktywności esterazy), który jest rozkładany przez bakterie oraz jednoczesnym obserwowaniu aktywności beta-glukozydazy umożliwiającej rozróżnienie Salmonella od innych Enterobacteriacae. Po inkubacji bakterie należące do rodzaju Salmonella spp. wzrastają jako kolonie o bardzo wyraźnym zabarwieniu od różowego do fioletowego. Wzrost innych mikroorganizmów jest zahamowany lub pojawiające się kolonie są bezbarwne lub niebieskie. Wynik dodatni można potwierdzić z wykorzystaniem krótkiego protokołu wykorzystującego testy lateksowe lub z wykorzystaniem standardowych protokołów opisanych w ISO.
Podłoże SALMA™ zostało opracowane i zaprojektowane zgodnie z najwyższymi wymaganiami jakościowymi. Metoda SALMA™ ONE DAY posiada walidację AFNOR gwarantującą pełną wiarygodność uzyskiwanych wyników.
VIDAS® SALMONELLA PT
Test VIDAS® SALMONELLA PT zaprojektowano z myślą specjalnie o laboratoriach przemysłowych. Łączy on w sobie zarówno prostotę i szybkość wykonania badań, jak również wysoką specyficzność. Pierwsze aparaty typu VIDAS® pojawiły się już w latach 90, jednakże najważniejszy element całego systemu to testy. Od samego początku istnienia systemu VIDAS® są one, cały czas udoskonalane, tak aby spełnić rygorystyczne wymogi jakościowe. Początkowo testy opracowywane były z wykorzystaniem przeciwciał, potem ich fragmentów, ale największy przełom przyniosło wykorzystanie rekombinantowych białek fagowych. Technologia wykorzystująca białka fagowe w diagnostyce jest nowoczesną metodą charakteryzującą się niespotykaną wcześniej specyficznością. Dzięki zastosowaniu białek fagowych możliwe było znaczne skrócenie czasu inkubacji próbki, a także uproszczenie całego procesu analitycznego. Konsekwencją tego jest możliwość uzyskania wyniku analizy już po zaledwie 19 godzinach od momentu pobrania danej próby, przy czym sama analiza w aparacie trwa ok. 45 minut. Biorąc pod uwagę ograniczone możliwości laboratoriów przemysłowych oraz ich wielkość czy specyficzność pracy, system VIDAS® został tak zaprojektowany, aby jego wdrożenie przebiegało szybko, a praca na aparacie nie wymagała specjalistycznej wiedzy mikrobiologicznej.
Ostania generacja testów VIDAS® SALMONELLA PT wprowadziła szereg zmian w procedurze. W tej chwili cała procedura opiera się na JEDENEJ naważce próbki, JEDNYM podłożu, JEDNYM pipetowaniu i JEDNYM dniu inkubacji. Po 18 godzinnej inkubacji badanej próbki na podłożu płynnym następuje przeniesienie próbki do paska testowego i umieszczenie testu w aparacie. Po ok. 45 minutach aparat podaje wynik jako dodatni lub ujemny bez konieczności jakiejkolwiek interpretacji przez laboranta. Dzięki temu, że cała procedura opiera się tylko na jednym pipetowaniu, możliwość popełnienia błędu przez użytkownika została znacznie zredukowana. System łączący w sobie zarówno prostotę wykonania, szybkość otrzymania wyników oraz wiarygodność jest szeroko rozpowszechniony na całym świecie. Jest to podstawowa i najbardziej rozpoznawalna na świecie platforma badawcza wykorzystywana w laboratoriach przemysłowych. Wiarygodność otrzymywanych wyników potwierdzona jest nie tylko przez zewnętrzne jednostki takie, jak AFNOR czy AOAC, ale również NordVal, MicroVal i kilkadziesiąt innych organizacji międzynarodowych, a także liczne referencje użytkowników. System VIDAS® może być wykorzystywany nie tylko do badania produktów żywnościowych przeznaczonych dla ludzi i zwierząt, ale również do badania prób środowiskowych oraz prób pochodzących z produkcji pierwotnej. Z wykorzystaniem niniejszej metody możliwe jest wykrywanie zarówno ruchliwych, jak i nieruchliwych bakterii Salmonella.
GENE-UP®
Kolejna propozycja firmy bioMérieux do wykrywania bakterii należących do rodzaju Salmonella spp. to wykorzystanie systemu GENE-UP®. System ten pracuje w technologii Real Time PCR i opiera się na wykrywaniu DNA szukanego drobnoustroju. Przeznaczony jest do laboratoriów wykonujących dużą liczbę badań (kilkadziesiąt lub kilkaset dziennie) oraz przeprowadzających różnego rodzaju analizy, nie tylko Salmonella czy L. monocytogenes. Podobnie jak każda metoda PCR do otrzymania prawidłowego wyniku niezbędnie jest przeprowadzenie trzech etapów. Pierwszym etapem badania jest naważenie odpowiedniej wielkości próby (zazwyczaj 25 gramów), a następnie inkubacja próby w określonym podłożu mikrobiologicznym. W przypadku procedur zastosowanych w aparacie GENE-UP®, a także niespotykanej wcześniej czułości i specyficzności metody, czas inkubacji trwa od 8 do maksymalnie 24 godzin. Po namnożeniu mikroorganizmów, następnym etapem metody PCR jest przeprowadzenie lizy komórek bakteryjnych, w ten sposób aby można było wykorzystać otrzymane DNA do reakcji PCR. Firma bioMérieux opracowała specjalne odczynniki do przeprowadzenia lizy mechanicznej. Cały proces uzyskania kwasu nukleinowego trwa około 5 minut, przy czym nie wymaga dodawania jakiegokolwiek odczynnika czy zmian temperatury i w całości opiera się na odczynnikach gotowych do użycia bez konieczności ich wcześniejszego przygotowania. Dzięki temu niezwykle czasochłonny i istotny proces uzyskiwania DNA, został zredukowany jedynie do przeniesienia próbki z pożywki namnażającej do probówki lizującej. Aby ułatwić pracę oraz zminimalizować ryzyko kontaminacji firma bioMérieux zaprojektowała i opatentowała specjalne zamknięcie próbówek lizujących, które wystarczy przebić tipsem bez konieczności ich otwierania. Ostatni etap wykrywania DNA patogenów to już właściwa reakcja PCR. Jednym z najważniejszych parametrów jakiegokolwiek testu PCR jest jego wiarygodność. W celu poprawy tego parametru i zniwelowania możliwości uzyskania błędnych wyników firma bioMérieux zastosowała specjalną technologię która, wykorzystuje sondy FRET (ang. fluorescent resonnance energy transfer) oraz automatyczne badanie temperatury topnienia uzyskanego produktu reakcji PCR. Oznaczenie temperatury topnienia umożliwia określenie specyficzności uzyskanego amplikonu. Dzięki tym dwóm, równolegle wykorzystywanym cechom użytkownik może być pewien, że otrzymany wynik jest specyficzny. Wyeliminowany jest etap związany z interpretacją wyników czy obliczaniem punktu przecięcia (CT). Ostateczny wynik oparty na trzech parametrach (specyficzna reakcja z sondami FRET, temperatura topnienia, krzywa reakcyjna) podawany jest w przejrzystej formie jako wynik dodatni lub ujemny. Równocześnie w każdej badanej próbce, równolegle przeprowadzona jest kolejna reakcja PCR będąca kontrolą wewnętrzną procesu. W przypadku wystąpienia inhibicji reakcji PCR użytkownik otrzyma informację, że dany test w konkretnej probówce reakcyjnej nie może być zinterpretowany z uwagi na błędny proces przeprowadzenia reakcji amplifikacji. Ten mechanizm sprawdzający indywidualnie i niezależnie każdą próbkę (a nie serię badań), zabezpiecza użytkownika przed uzyskaniem wyników fałszywie ujemnych.
Firma bioMérieux od lat współpracuje z przemysłowymi laboratoriami mikrobiologicznymi i system GENE-UP® został zaprojektowany specjalnie dla nich. Z tego powodu oprócz wysokiej specyficzności czy wiarygodności wyników, ważnym elementem jest prostota wykonania testów. Dlatego wszystkie procedury wyglądają w ten sam sposób i ograniczają się tylko do dwóch pipetowań – pobrania próbki do probówki lizującej, a następnie przeniesienie badanej próbki do probówki reakcyjnej.
System GENE-UP® działa w oparciu o dwa rodzaje oprogramowania. Jeżeli użytkownik bada tylko podstawowe patogeny takie, jak np. Salmonella czy Listeria, wtedy zalecane jest oprogramowanie „ROUTINE”. Oprogramowanie to nie wymaga od użytkownika wiedzy z zakresu biologii molekularnej i jego obsługa ogranicza się do wybrania oznaczenia i odczytania wyniku. W przypadku użytkowników, którzy chcieliby wykorzystać aparat do innych celów niż tylko oznaczenie patogenów, zalecane jest oprogramowanie „OPEN”, które umożliwia dowolne zaprogramowanie cyklu pracy oraz pozwala na pracę z większością komercyjnie dostępnych sond czy testów. Oprogramowania te działają niezależnie od siebie dzięki czemu użytkownik może na jednym aparacie korzystać z oprogramowania ROUTINE lub OPEN.
Wszystkie testy wykorzystywane razem z aparatem GENE-UP® posiadają walidacje AFNOR oraz AOAC potwierdzające ich niezrównaną wiarygodność i specyficzność.
Podsumowanie
Wykrywanie patogenów w żywności obarczone jest dużym ryzykiem, ponieważ wynik ma ogromny wpływ nie tylko na reputację firmy, ale wiąże się z ogromnymi kosztami. Uzyskiwanie błędnych wyników zarówno fałszywie negatywnych, jak i fałszywie pozytywnych powoduje generowanie znaczących kosztów. Co dzieje się w przypadku „fałszywego alarmu”? Która procedura została zastosowana? Jak wiarygodne są wyniki? Czy liczba badanych prób jest wystarczająca, czy może po prostu badamy zbyt mało, żeby znaleźć zanieczyszczenie? To są pytania i wątpliwości przed jakimi staje każdy kierownik laboratorium.
Firma bioMérieux to nie tylko dostawca usług, ale przede wszystkim to partner, który pomoże Państwu sprawnie wdrożyć i później użytkować rozwiązanie najbardziej dostosowane do Państwa potrzeb. Razem z systemami firmy bioMérieux otrzymają Państwo nie tylko najbardziej wiarygodne rozwiązania do wykrywania Salmonelli, ale przede wszystkim 50 lat doświadczeń firmy bioMérieux, lidera w rozwiązaniach dla laboratoriów mikrobiologicznych. Pełne wsparcie dedykowanego zespołu ludzi z możliwością zdalnego dostępu do Państwa aparatu przez serwis techniczny (VILINK). Dzięki czemu proces wdrożenia aparatu do pracy rutynowej przebiegał będzie szybko i bezproblemowo.
