Szybko i pewnie, czyli jak? Wykrywanie bakterii z rodzaju Listeria spp. w produkcie i środowisku wg Sterbios

Listeria monocytogenes to mikroorganizm, który u osób w grupie ryzyka może wywołać listeriozę inwazyjną – chorobę charakteryzującą się bardzo wysoką śmiertelnością (nawet na poziomie 30%). Bakteria ta ma przy tym wyjątkową zdolność namnażania się w temperaturze chłodniczej (już od około 4°C), przez co może rozwijać się nawet przy zachowanym łańcuchu chłodniczym. Wzrost L. monocytogenes nie powoduje widocznego zepsucia się żywności, więc konsument nie ma świadomości zagrożenia. Wobec wysokiego ryzyka związanego ze spożyciem zakażonych produktów spożywczych, wdrażanie skutecznych i efektywnych środków kontrolnych jest niezbędne dla zapewnienia bezpieczeństwa żywności.

Metody oznaczania Listeria monocytogenes

Wykrywanie L. monocytogenes w żywności i środowisku produkcyjnym można prowadzić różnymi metodami, jednak należy mieć świadomość konieczności doboru takiego rozwiązania, które w sposób czuły i pewny zaalarmuje o ewentualnym zagrożeniu.

Norma EN ISO 11290-1/A1:2005 opisuje podstawowe metody oznaczania obecności oraz liczby bakterii L. monocytogenes w żywności i paszach. Tzw. metoda ISO przy detekcji Listeria monocytogenes wymaga użycia dwóch bulionów namnażających – ½ Fraser i 1 Fraser oraz dwóch różnych podłóż stałych – obowiązkowego, chromogennego agaru Listeria wg. Ottaviani i Agosti (występującego na rynku pod różnymi akronimami – np. AL Agar, ALOA itp.) oraz drugiego selektywnego podłoża do wyboru.

AL Agar opracowany przez BIO-RAD Laboratories jest specyficznym podłożem, które oprócz zastosowania w metodzie referencyjnej, może być używane w alternatywnym, krótkim protokole dającym wynik już po 24 h inkubacji na płytce. Krótka metoda AL została zatwierdzona przez NF Validation zgodnie z protokołem ISO 16140, jako metoda do wykrywania Listeria monocytogenes i innych gatunków Listeria spp. we wszystkich produktach żywnościowych do spożycia dla ludzi i w próbkach środowiskowych. Dzięki jawnej i udokumentowanej tzw. walidacji strony trzeciej, wprowadzenie metody do stosowania w laboratorium jest proste, a dostarczone wyniki, po weryfikacji metody, mogą być uznawane za wiarygodne w rozumieniu rozporządzenia 2073/2005 (z późniejszymi zmianami). Należy zatem podkreślić, że nawet wybierając „normatywne podłoże chromogenne” do oznaczania Listeria spp., warto kierować się przede wszystkim jego jakością i dodatkowymi możliwościami, jakie ono oferuje.

Mnogość operacji do wykonania w metodzie referencyjnej oraz relatywnie długi czas do uzyskania wyniku (nawet 5–7 dni!) sprawia, że laboratoria przyzakładowe poszukują szybszych metod analitycznych, tak by bezpieczna żywność mogła jak najszybciej trafić na półki sklepowe. Na rynku jest wiele propozycji metod alternatywnych, mogących uprościć i skrócić to kluczowe badanie.

Fot. 1. Wzrost Listeria ivanovii na agarze AL

Poszukując metod alternatywnych warto uwzględnić takie czynniki jak:

• Czułość i specyficzność metody;
• Rodzaj matrycy (próbki) i specyfikacja jakościowa;
• Oczekiwany czas do uzyskania wyniku;
• Posiadane zaplecze laboratoryjne i/lub możliwości jego rozbudowy.

Obecny rynek oferuje analitykowi szeroki wybór metod znacznie różniących się między sobą powyższymi wyróżnikami. Przedmiotem oznaczenia mogą być próbki produktów żywnościowych, półproduktów, surowców i opakowań, a także próbki środowiskowe. Te wszystkie czynniki będą warunkowały wybór idealnej metody (lub zestawu metod) wartej do uwzględnienia w codziennym harmonogramie badań.

Podłoża chromogenne – RAPID’ L. mono i RAPID’ Listeria spp.

BIO-RAD Laboratories to jeden z najbardziej doświadczonych producentów wysokiej jakości odczynników i podłoży mikrobiologicznych na świecie, intensywnie rozwijający portfolio specjalistycznych podłoży chromogennych. Podłoża RAPID upraszczają analizę i skracają czas do wyniku w badaniach żywności, wody i środowiska produkcyjnego.

Metoda z wykorzystaniem podłoża RAPID’ L.mono została zatwierdzona przez NF Validation zgodnie z protokołem NF EN ISO 16140-2:2016, jako metoda alternatywna dla metody referencyjnej w normie NF EN ISO 11290-1, do wykrywania pałeczek Listeria monocytogenes i innych gatunków Listeria spp. we wszystkich produktach spożywczych i w próbkach środowiskowych. RAPID’L. mono to wyjątkowe podłoże chromogenne, które umożliwia wykrywanie, oznaczanie liczby oraz wstępną identyfikację gatunkową bakterii z rodzaju Listeria spp. Zasada działania podłoża RAPID’ L.mono (RLM) polega na swoistym wykrywaniu aktywności fosfolipazy C L. monocytogenes (PIPLC) oraz braku zdolności tego gatunku do metabolizowania ksylozy. Po 24 godzinach inkubacji, L. monocytogenes tworzy charakterystyczne niebieskie kolonie (błękitne, szaro-niebieskie lub ciemno-niebieskie) bez żółtego halo. Należy zwrócić uwagę na występującą w żywności Listeria ivanovii, tworzącą niebieskozielone kolonie z żółtym halo (świadczącym o wykorzystaniu ksylozy), pojawiającym się po 24–48 godzinach inkubacji. Kolonie innych gatunków Listeria są białe, a wokół nich może pojawić się żółte halo. Zawarty w podłożu dodatek selektywny hamuje wzrost większości flory towarzyszącej – w tym bakterii Gram(-), Gram(+), pleśni i drożdży. Przygotowanie prób w metodzie RAPID’L.mono przebiega z wykorzystaniem bulionu ½ Fraser (wykrywanie) i wody peptonowej (oznaczanie liczby).

Fot. 2. Listeria ivanovii na agarze RAPID’ L. mono

Podsumowując, wykorzystanie RAPID’ L.mono daje kilka wymiernych korzyści. Krótki czas do wyniku, wysoka swoistość i czułość, a także wstępna identyfikacja gatunkowa to nie wszystko. Podłoże można wprowadzić w sposób elastyczny, ponieważ dzięki przygotowaniu próby w bulionach „normatywnych” możemy łatwo przechodzić między metodą referencyjną i alternatywną (w zależności od potrzeb).

W wielu laboratoriach identyfikacja gatunkowa bakterii z rodzaju Listeria może nie być konieczna – zwyczajnie wszystkie powinny być nieobecne. Podłoże RAPID’ Listeria spp. to chromogenna pożywka, której działanie opiera się na detekcji aktywności β‑D-glukozydazy. Kolonie Listeria spp. rosną na niebieski i niebiesko-zielony kolor. Selektywność podłoża zapewnia obecność chlorku litu i mieszanki antybiotyków, która hamuje rozwój flory towarzyszącej, zwłaszcza z rodzaju Bacillus. Proste przygotowanie próbki z użyciem ½ Frasera, jako bulionu namnażającego, daje nam wynik w 48 h od pobrania próbki

Szybkie testy wymazowe – wykrywanie L. monocytogenes i Listeria spp. w środowisku

Najprostsze, chromogenne wymazowe metody oznaczania obecności Listerii patogennych można prowadzić już przy minimalnym wyposażeniu laboratoryjnym. Zazwyczaj jedyne, co musi mieć technik wykonujący taki test, to mini-cieplarka do inkubacji próby. W zależności od oczekiwanej specyficzności wyniku można wybierać testy wykrywające w środowisku Listeria spp. (Listeria Swab) lub takie, które informują o obecności chorobotwórczych L. monocytogenes i L. ivanovii (SwabSURE-ListeriaP).

SwabSURE-ListeriaP to zestaw, który z powodzeniem jest wykorzystywany w wielu zakładach produkcyjnych w Polsce. Test jest przeznaczony do jakościowego wykrywania patogennych bakterii z rodzaju Listeria (L. monocytogenes i L. ivanovii) na powierzchniach mających kontakt z żywnością oraz w środowisku produkcyjnym. Pozwala na wykrycie w pobranej próbie wymazu już 1 jtk L. monocytogenes, specyficznie hamując wzrost innych mikroorganizmów tj. Bacillus spp., Enterococcus spp., Micrococcus spp., Klebsiella spp. itp. Do pobrania wymazu z powierzchni stosuje się wstępnie zwilżoną, gąbkową wymazówkę, dołączoną do zestawu. Porowata struktura wymazówki pozwala na zwiększenie odzysku, a wykorzystany do zwilżenia bufor neutralizujący inaktywuje pozostałości środków dezynfekcyjnych. Zasada działania testu oparta jest na specyficznej pożywce SwabSURE-ListeriaP, która wykrywa aktywność PI-PLC, enzymu specyficznego dla L. monocytogenes i L. ivanovii, a który jest uważany za ważny czynnik wirulencji Listeria spp. Chromogenny substrat obecny w pożywce jest utleniany przez PI-PLC do barwnego produktu. Obecność L. monocytogenes lub L. ivanovii w badanej próbce spowoduje zmianę barwy pożywki ze słomkowo-żółtej na turkusowo-niebieską.

W zależności od ustalonych w zakładzie kryteriów higienicznych, może być wymagane wykazanie nieobecności rodzaju Listeria spp. na powierzchniach produkcyjnych. Listeria Swab to gotowy zestaw, zawierający wymazówkę oraz podłoże chromogenne oparte na zdolności Listeria spp. do hydrolizy eskuliny. Jeśli badana próbka zawiera Listeria spp., to w probówce zaobserwowany zostanie charakterystyczny, czarny osad. Co ciekawe, główka wymazówki wykonana jest z alginianu wapnia, który całkowicie rozpuszcza się w kontakcie z pożywką. Dzięki temu mamy pewność, że pobrane z powierzchni mikroorganizmy zostały uwolnione do podłoża i miały możliwość wzrostu.

Real-Time PCR – gdy liczy się czas, czułość i specyficzność

Klasyczne metody mikrobiologiczne, oparte na obserwacji wzrostu mikroorganizmów na podłożach agarowych, charakteryzują się dłuższym czasem uzyskiwania wyniku, ze względu na konieczność uprzedniego przeprowadzenia przez bakterie wielokrotnych podziałów komórkowych w miejscu dostrzegalnych kolonii. Istnieją metody alternatywne, które pozwalają skutecznie wykrywać obecność mikroorganizmów w próbkach bez konieczności ostatecznej hodowli na podłożu stałym i związanej z tym obserwacji kolonii. Real-Time PCR to metoda biologii molekularnej, polegająca na wykrywaniu specyficznych odcinków DNA w próbie. Stosowane tzw. „targetowe” odcinki DNA są tak dobierane w obrębie genomu bakterii, by ich obecność stanowiła jednoznaczną podstawę w interpretacji wyniku. Jeśli więc w pre-namnożonej próbie wykryty zostanie charakterystyczny dla L. monocytogenes materiał genetyczny, będzie to dowód jej obecności w produkcie. Czas do wyniku w tej metodzie, w zależności od dobranego testu, metody przygotowania próby, walidacji metody itp., może oscylować nawet w zakresie 20–28h. Czułość dobrej jakości testu, potwierdzona walidacjami zewnętrznymi, powinna pozwalać na wykrycie 1 jtk L. monocytogenes w 25g badanej próbki.

Przygotowanie próbki do badania metodą PCR jest identyczne jak w metodzie klasycznej – punktem wyjścia zawsze jest próbka żywności o masie 25g, rozcieńczona dziesięciokrotnie w odpowiednim bulionie. Metoda może być także stosowana do badania prób pobranych ze środowiska produkcyjnego. Po wstępnym namnożeniu próbki przez 18–26 godzin, przeprowadza się izolację materiału genetycznego.

Metoda Real-Time PCR pozwala wykrywać nawet bakterie słabo rosnące, osłabione działaniem środków dezynfekujących. W trakcie inkubacji w bulionie w cieplarce, w warunkach komfortowych, mają one szanse namnożyć się do poziomu detekcji. Szczególną uwagę należy zwrócić na czułość i specyficzność metody molekularnej w kontekście próbek środowiskowych. To właśnie w tych próbkach mamy do czynienia z Listerią, która jest zestresowana różnymi niekorzystnymi czynnikami środowiskowymi – środkami myjącymi, dezynfekującymi itp. Takie komórki mogą na podłożach generować niespecyficznie kolonie albo przechodzić w stan VBNC (ang. Viable But Non Culturable), czyli w ogóle nie tworzyć kolonii z powodu ograniczenia metabolizmu i funkcji życiowych do minimum. Metody molekularne w takiej sytuacji mogą poprawić efektywność badań, nie tylko w kontekście czasu do wyniku, ale także jednoznaczności interpretacji.

W praktyce mogą też istnieć matryce, które będą zawierały znaczne ilości wolnego DNA, pochodzącego z licznych komórek Listeria spp. zniszczonych podczas przetwarzania surowca. Jeśli w trakcie procesu weryfikacji metody w laboratorium ten problem zostanie zauważony, można zastosować odczynnik redukujący poziom wolnego DNA do nieoznaczalnego metodą PCR, eliminując tym samym ryzyko wyników fałszywie dodatnich.

Wybierając gotowe zestawy do detekcji L. monocytogenes warto rozważyć oferowaną metodykę pod kątem podłoża do wstępnego namnożenia prób. W większości przypadków, jeśli uzyskamy w metodzie PCR wynik dodatni, będziemy planowali potwierdzenie wyniku metodą hodowlaną. Jedną z dróg potwierdzeń jest wykorzystanie metody referencyjnej. Jeżeli więc wprowadzana przez nas metoda Real-Time PCR będzie bazowała na namnożeniu w „normatywnym” bulionie ½ Fraser, to w przypadku wyniku pozytywnego łatwo będzie „powrócić” do worka i kontynuować potwierdzanie metodą referencyjną. Jeśli bulion nie jest zgodny z EN-ISO 11290-1/A1:2005 to ewentualne potwierdzenie wyniku będzie wymagało przygotowania nowej naważki produktu i ponownej wstępnej inkubacji próbki w bulionie „normatywnym”.

Interesującym rozwiązaniem są też testy tzw. „multiplex”, które w trakcie jednej analizy umożliwiają wykrywanie dwóch lub więcej „targetów”. Przykładem takiego rozwiązania są testy jednocześnie umożliwiające wykrywanie zarówno Listeria spp., jak i L. monocytogenes. Taki wynik, uzyskany mniejszym nakładem pracy i kosztów, niesie zdecydowanie największą wartość poznawczą i pozwala skutecznie zarządzać ryzykiem w kontekście bezpieczeństwa żywności.

Wybierając system do Real-Time PCR warto sprawdzić, czy dana metoda spełnia wymagania PN-EN ISO 22174 oraz norm towarzyszących. Obowiązkowe kontrole, które należy uwzględnić to kontrola pozytywna i negatywna oraz kontrola wewnętrzna procesu – szczególnie istotna w kontekście stwierdzenia ewentualnej inhibicji i wykluczania wyników fałszywie ujemnych. Wybierając gotowy test, warto szukać takiego, który zawiera wszystkie te kontrole. Najistotniejsze parametry testu to specyficzność, czułość i dokładność. Należy więc przy wyborze kierować się najlepszymi statystykami uzyskanymi w trakcie walidacji zewnętrznej – im dokładniejszy, czulszy i bardziej specyficzny test – tym nasz wynik będzie bardziej wiarygodny. Z kolei zastosowanie bulionów „normatywnych”, a nie specyficznych dla jednego producenta, daje nam większą elastyczność pracy. Decyzja o wdrożeniu metody molekularnej wiąże się z większym nakładem kosztów – dobór odpowiedniego, wykwalifikowanego dostawcy sprawi, że inwestycja przyniesie wymierne korzyści i zmniejszy ryzyko wypuszczenia na rynek produktu niezgodnego z wymogami jakościowymi.

Podsumowanie

Bakterie z rodzaju Listeria spp. stanowią wyzwanie w kontekście zapewnienia bezpieczeństwa zdrowotnego żywności. Stosowane techniki analityczne powinny umożliwiać analitykom wydawanie wiarygodnego wyniku w krótkim czasie, tak by bezpieczny produkt jak najszybciej trafił do konsumenta. Wprowadzając metody w laboratorium – referencyjną, alternatywną płytkową czy metodę PCR, warto brać pod uwagę także bulion do pre-namnożenia i temperatury inkubacji. Jeśli będą zbieżne, to będziemy mogli dowolnie pokierować późniejszym badaniem. Niezależnie od tego, co dalej zrobimy z próbką – zawsze zaczynamy tak samo. Dobrana metoda powinna odpowiadać na potrzeby klienta w zakresie czułości, specyficzności i czasu do wyniku. Odpowiedzialny dostawca rozwiązań laboratoryjnych oprócz sprzedaży odczynników zapewni niezbędne wsparcie wdrożeniowe i opiekę merytoryczną w zakresie oferowanych rozwiązań.

 Artykuł jest częścią opracowania - FoodFakty NAWIGATOR - Listeria w przemyśle spożywczym

www.sterbios.pl