W żywności jak i środowisku występują najróżniejsze mikroorganizmy (bakterie, grzyby, pleśnie, wirusy), które mogą być potencjalnie bardzo niebezpieczne. Niezwykle rzadko, nawet organizmy teoretycznie nieszkodliwe i rutynowo wykorzystywane przy produkcji jogurtów, takie jak np. Lactobacillus bulgaricus mogą wywołać niewydolność ogólnonarządową. Jednak tylko kilka rodzajów bakterii oraz wirusów wywołuje powszechnie choroby po spożyciu zanieczyszczonej żywności. Do grupy takich mikroorganizmów oprócz Salmonelli czy Norovirusów zaliczamy również Listerię monocytogenes. W przeciwieństwie do okazjonalnych patogenów, takich jak Proteus, Enterobacter, które powodują chwilowe zaburzenia funkcjonowania układu pokarmowego, L. monocytogenes może prowadzić do rzadkiej, ale bardzo poważnej choroby zakaźnej zwanej listeriozą.
Listeria - charakterystyka
Listeria monocytogenes została po raz pierwszy wyizolowana w Cambridge w roku 1924 przez Murray i współpracowników z królików, które zmarły na nieznaną wówczas chorobę powodującą znaczny wzrost monocytów we krwi. Patogen, początkowo został nazwany Bacterium monocytogenes, a następnie w 1940 r. nazwa rodzajowa została zmieniona na Listeria na cześć angielskiego chirurga Sir. Josepha Lister. Pierwszy opisany przypadek zatrucia spowodowany tą bakterią miał miejsce w Kanadzie w roku 1983 po spożyciu zanieczyszczonej surówki z białej kapusty. Obecnie przyjmuje się, że 95% przypadków listeriozy wywołana jest właśnie po spożyciu zainfekowanej żywości.
Sekwencjonowanie genu kodującego 16S rRNA bakterii wywołującej listeriozę pozwoliło jednoznacznie określić jej przynależność gatunkową do grupy, w której skład wchodzą między innymi Lactobacillus czy Bacillus. Najbardziej znane 6 gatunków Listerii to L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. welshimerii, L. seeligeri oraz L. grayi, jednak w ostatnich latach zidentyfikowano kolejne 11 nowych gatunków Listerii. Z żywności, najczęściej izolowane są tylko dwa gatunki L. monocytogenes oraz L. innocua.
Bakterie z rodzaju Listeria należą do grupy bakterii Gram dodatnich, są to pałeczki, które nie tworzą otoczek ani przetrwalników. Mikroorganizmy te wykazują zdolność wzrostu w warunkach tlenowych lub względnie beztlenowych w temperaturze od 0 do 45℃. Mają bardzo duże zdolności adaptacyjne. Znoszą krótkotrwałą pasteryzację, długotrwałe wysuszenie lub głębokie zamrożenie. Właśnie te cechy fenotypowe, a zwłaszcza możliwość wzrostu w temperaturze poniżej 4℃ sprawiają, że jest to tak groźny patogen występujący w żywności. Równocześnie bakterie te charakteryzują się zdolnością do zwiększania odporności na wymienione czynniki w momencie, gdy znajdują się w sytuacji stresowej co powoduje, że ich eliminacja z żywności jest jeszcze trudniejsza.
Listerioza
Od kilku lat notuje się zauważalny wzrost przypadków listeriozy na świecie, chociaż różnie wygląda to w poszczególnych krajach. Jest to bardzo niepokojące z uwagi na fakt, że L. monocytogenes wywołująca tą chorobę należy do jednego z najbardziej niebezpiecznych mikroorganizmów dla zdrowia człowieka. W Polsce rocznie notuje się kilkadziesiąt przypadków listeriozy. Według danych Państwowego Zakładu Higieny (PZH) oraz Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego (KOROUN), w roku 2010 stwierdzono 50 przypadków listeriozy, natomiast w roku 2017 takich przypadków było już ponad 100.
Dla ludzi, większość gatunków Listerii nie jest patogenna. Prawie wszystkie przypadki listeriozy wywołane są przez L. monocytogenes, ale zdarzają się zatrucia spowodowane L. ivanovi bądź L. seeligeri. Ponieważ L. monocytogenes jest patogenem szybko ewoluującym (obecnie wyróżniania się 13 różnych stereotypów, niebezpiecznych dla człowieka) to potrafi równie szybko adaptować się do nowego środowiska, a także wykazuje naturalną odporność na niektóre antybiotyki. Listerioza od lat zaliczana jest do chorób odzwierzęcych. Bakterie wywołujące listeriozę, przenoszą się na gospodarza poprzez takie czynniki jak: gleba, woda, ścieki, zanieczyszczone rośliny, odchody zwierząt, padlina, pasze, kiszonki czy też śmieci domowe. Źródłem bakterii mogą być najróżniejsze zwierzęta, takie jak: ssaki (dzikie i domowe), gryzonie, owce, kozy, bydło, świnie czy ptaki. Pałeczki Listerii izolowano także od ryb czy gadów. Również ludzie mogą być nosicielami tej bakterii, przy czym szacuje się, że bezobjawowych nosicieli jest od 5 do 10%. Tak więc można stwierdzić, że środowisko jest głównym źródłem zanieczyszczenia pałeczkami Listerii pasz czy surowej żywności, które może prowadzić do skażenia zakładów produkujących żywność, a w konsekwencji gotowych produktów żywnościowych.
Uważa się, iż nieprzestrzeganie odpowiedniej praktyki produkcyjnej czy higieny w zakładach, a także niewystarczająca obróbka cieplna produktów jest głównym powodem skażenia żywności. Główne produkty, które mogą być źródłem infekcji to: sery miękkie i dojrzewające, surowe mleko, śmietana, jaja, lody, mięso, wędzone ryby, wieprzowina, kiełbasy, surowe warzywa i owoce, a także mrożonki czy zestawy dań gotowe do spożycia. Możliwość zachorowania na listeriozę w mniejszym stopniu dotyczy ludzi zdrowych, jednak choroba ta stanowi bardzo poważne zagrożenie dla ludzi starszych lub osób z obniżoną odpornością. Mimo, że listerioza występuje stosunkowo rzadko (np. w Unii Europejskiej w 2014 roku potwierdzono 2207 zachorowań, w USA odnotowano ok. 1600) to w ponad 90% przypadków infekcja pałeczkami Listerii wymaga hospitalizacji, a jej śmiertelność jest szacowana na 20-30%. Z tego też powodu listerioza została zakwalifikowana do chorób występujących powszechnie, które stanowią realne zagrożenie dla życia człowieka. Na uwagę zasługuje fakt, że kobiety w ciąży są około 17 razy bardziej podatne na listeriozę, a pałeczki Listerii mają zdolność przechodzenia przez łożysko i namnażania się w nim. Dlatego jest to jeden z głównych czynników powodujących zakażenia okołoporodowe pochodzenia bakteryjnego prowadzące w 22% do porodu martwego dziecka lub jego szybkiego zgonu.
Okres inkubacji choroby to nawet 70 dni, dlatego ciężko określić dokładną dawkę infekcyjną. Pewne jest jednak, że infekcja w 95% spowodowana jest spożyciem zanieczyszczonej żywności. Przyjmuje się, że objawy kliniczne listeriozy pojawiają się po spożyciu żywności zawierającej od 10^3 CFU/g do 10^8 CFU/g bakterii L. monocytogenes.
Listerioza jest na piątym miejscu wśród najczęściej wykrywanych u ludzi chorób odzwierzęcych (po kampylobakteriozie, salmonellozie, jersiniozie i infekcjach STEC). Z tego powodu Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności monitoruje rynek żywieniowy obejmujący obszar wszystkich krajów członkowskich. Zgłaszanie przypadków ludzkiej listeriozy jest obowiązkowe na terenie większości państw europejskich. Również dzięki specjalnemu Systemowi Wczesnego Ostrzegania o Niebezpiecznej Żywności i Paszach (ang. RASFF) możliwa jest szybka wymiana informacji na temat zanieczyszczonej żywności, pasz czy materiałów mających kontakt z żywnością.
Prawo Unii Europejskiej odpowiadające za bezpieczeństwo każdego elementu łańcucha żywieniowego wymaga, aby produkt dopuszczony do spożycia był wolny od mikroorganizmów, ich metabolitów lub toksyn w ilościach zagrażających zdrowiu i życiu ludzi. W rozporządzeniu Komisji Europejskiej 2073/2005 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych mamy jasno określone kryteria dotyczące L. monocytogenes. W zależności od rodzaju żywności i jej przeznaczenia badana próba nie powinna zawierać żadnej bakterii w 25 gramach badanej próbki lub jej liczba dopuszczona jest do 100 jtk/g na koniec terminu przydatności do spożycia.
Wykrywanie L. monocytogenes
W ciągu ostatnich 50 lat opracowano i wdrożono wiele metod wykrywania L. monocytogenes w środowisku jak i w produktach żywnościowych. Początkowo dużym wyzwaniem było wykrycie małej liczby bakterii z rodzaju Listerii w obecności dużej mikroflory towarzyszącej. Jednakże opracowanie specjalnych podłoży mających z jednej strony wzmacniający wpływ na wzrost Listerii, a z drugiej hamujący wpływ na wzrost mikroflory towarzyszącej, pozwoliło na stworzenie specyficznych metod wykrywania Listerii.
Fot. 1. Podłoże wybiórcze ALOA®
Jednym z najbardziej znanych selektywnych podłoży agarowych, są opracowane w późnych latach 80-tych podłoża Oxford i Palcam. Na podłożach tych skutecznie hamowany jest wzrost mikroorganizmów innych niż Listeria dzięki czemu możliwa jest jej łatwiejsza identyfikacja. Zastosowanie na wcześniejszym etapie podłoży namnażających, takich jak pół-Fraser i Fraser, skutecznie zwiększa prawdopodobieństwo wzrostu bakterii z rodzaju Listeria, które mogły być uszkodzone podczas procesu produkcyjnego lub są bardzo osłabione. Metoda ta, czyli wstępne dwuetapowe namnożenie na bulionie, a później hodowana na podłożach, mimo że cały czas jest stosowana przez niektóre laboratoria charakteryzuje się długim czasem oczekiwania na wynik (do 5 dni), a także wymaga dalszych etapów badawczych, które pozwolą na rozróżnienie poszczególnych gatunków. Szczególnie istotne jest odróżnienie patogennej L. monocytogenes od innych niepatogennych gatunków, takich jak np. L. innocua lub L. seeligeri. Dlatego w późnych latach 90-tych zostało opracowane nowe podłoże wybiórcze ALOA® (Agar Listeria według Ottaviani i Agosti). Na podłożu tym Listeria rośnie w postaci niebiesko-zielonych, okrągłych kolonii (dzięki aktywności β-glukozydazy rozkładającej specyficzny substrat chromogenny), podczas gdy L. monocytogenes wykazuje wzrost z charakterystyczną matową strefą zmętnienia. Dzięki temu możliwe jest odróżnienie w prosty sposób gatunku L. monocytogenes od pozostałych gatunków Listeria. Strefa zmętnienia powstaje w wyniku aktywności fosfolipazy, charakterystycznej dla patogennych gatunków Listeria. Skład podłoża ALOA® jest zgodny z normą ISO 11290:2017, jednakże firma bioMérieux opracowała specjalną procedurę badawczą do jak najszybszego wykrywania bakterii bez konieczności posiadania specjalistycznego sprzętu. Certyfikowana metoda ALOA® ONE DAY (NF VALIDATION: ALOA® One Day i ALOA® Count) umożliwia wykrywanie pałeczek L. monocytogenes oraz Listeria spp. w żywności i próbkach środowiskowych w czasie 48 godzin. Dzięki specjalne dobranym podłożom oraz temperaturom inkubacji możliwe jest znaczne skrócenie czasu w stosunku do znormalizowanej metody. Jednakże, w wielu przypadkach 48 godzin to czas zdecydowanie za długi. Wielu producentów żywności poszukuje metod, dzięki którym wynik badania możliwy byłby do uzyskania w jak najkrótszym czasie. Właśnie dla tego rodzaju odbiorców opracowane zostały metody zautomatyzowane. Metody te charakteryzują się nie tylko niezrównaną specyficznością, krótszym czasem uzyskania wyników, ale umożliwiają znaczne zwiększenie przepustowości laboratorium. Obecnie w ofercie firmy bioMérieux znajdują się dwie zautomatyzowane metody – jedna immunofluorescencyjna wykrywająca antygeny bakteryjne, druga wykorzystująca technologię Real-Time PCR oparta na wykrywaniu specyficznych fragmentów
bakteryjnego DNA.
Fot. 2. VIDAS®
Metoda immunofluorescencja została opracowana specjalnie z myślą o laboratoriach przemysłowych. W takich laboratoriach wykrywa się głównie takie patogenny jak: Salmonella czy L. monocytogenes. Do przeprowadzenia tego rodzaju testów niezbędny jest aparat VIDAS® lub jego mniejsza wersja MINI VIDAS®. Mimo, że aparat ten został wprowadzony na rynek w latach 90. to cały czas z powodzeniem spełnia swoją funkcję. Możliwe jest to dzięki temu, że aparat stanowi tylko platformę odczytu wyników, natomiast za czułość czy specyficzność otrzymanych rezultatów odpowiadają testy. To właśnie opracowywanie nowych testów i ich kolejnych generacji, w których podstawę oznaczenia zamiast początkowo stosowanych swoistych przeciwciał stanowią dzisiaj coraz częściej ich odpowiednio wyselekcjonowane fragmenty lub białka fagowe, daje możliwość upraszczania procedur i otrzymywania wyników szybciej, z jeszcze większą dokładnością. Aparaty typu VIDAS®, będące najbardziej rozpowszechnioną platformą do badania patogenów w laboratoriach przemysłowych na świecie, z powodzeniem wykonują tysiące testów dziennie, a ich wiarygodność została potwierdzona w niezliczonych badaniach międzylaboratoryjnych. Jednakże wykrywanie L. monocytogenes to tylko jeden z możliwych do wykonania testów. Obecnie wśród producentów zauważalna jest potrzeba wykrywani nie tylko L. monocytogenes, ale wszystkich gatunków należących do rodzaju Listeria. Poszukiwanie bakterii Listerii spp. w środowisku produkcyjnym jest bardzo dobrym wskaźnikiem pomagającym w identyfikacji miejsc sprzyjających rozwojowi bakterii z rodzaju Listeria, a ich wczesne wykrycie daje producentowi żywności dodatkowy czas i jest swojego rodzaju żółtym alarmem ostrzegającym przed pojawieniem się sprzyjających warunków do rozwoju patogennej L. monocytogenes. Firma bioMérieux opracowała również specjalny test VIDAS® LDUO, dzięki któremu użytkownik otrzymuje bezpośrednio wynik, bez konieczności wykonywania dodatkowych testów, mówiący zarówno o obecności L. monocytogenes jak również innych bakterii z rodzaju Listerii w badanej próbce. Pozwala to zoptymalizować koszty analiz i ograniczyć liczbę wykonywany testów potwierdzających.
Fot. 3. MINI VIDAS®
Rozwój technologii wprowadza również nowe metody wykrywania mikroorganizmów. Jedna z takich metod opiera się na technice Real-Time PCR. Detekcja molekularna, zalecana jest dla laboratoriów usługowych oraz przemysłowych laboratoriów mających duże ilości badań (ponad 100 dziennie). Jej stosowanie wymaga posiadania specjalistycznego sprzętu tj. termocyklera (GENE-UP®), a także odpowiedniego wyposażenia laboratorium. Laboratoria pracujące z jakimkolwiek termocyklerem powinny posiadać minimum dwie (optymalnie trzy) strefy, w których przeprowadzane będą kolejne etapy detekcji molekularnej. Mimo, że procedury wykorzystujące technikę Real-Time PCR nie należą do najłatwiejszych, to jednak firma bioMérieux opracowując specjalny aparat GENE-UP® oraz oprogramowanie do niego, a także specjalistyczne testy cały czas miała na uwadze docelowe miejsce jego zastosowania, czyli laboratorium przemysłowe. Opracowane testy nie tylko w znaczącym stopniu uprościły całą procedurę badawczą zmniejszając liczbę pipetowań (z kilkunastu w procedurach konkurencji) do dwóch, ale również specjalne oprogramowanie i technologia FRET (ang. fluorescent resonnance energy transfer), przyczyniły się do znacznego zwiększenia wiarygodności uzyskiwanych wyników. Jednym z ciekawszych udogodnień wprowadzonych do procedury GENE-UP® jest jednoetapowa liza mechaniczna oparta na gotowych do użycia odczynnikach, czy zautomatyzowany odczyt wyników z wykorzystaniem nie tylko siły sygnału, ale również temperatury topnienia produktu.
Fot. 4. GENE-UP®
Podsumowanie
Dzięki tak różnym metodom: od klasycznych znormalizowanych, poprzez nowe podłoża chromogenne, aż do różnego rodzaju aparatów, firma bioMérieux może zapewnić kompleksowe rozwiązanie dostosowane dla każdego laboratorium. Nasi specjaliści nie tylko pomagają w wyborze odpowiedniej metody (każda z opisanych metod wykrywania bakterii z rodzaju Listeria odpowiednia jest dla innego laboratorium), ale również pomogą Państwu wdrożyć daną metodę do pracy rutynowej w Państwa laboratorium.
Podsumowując należy stwierdzić, że L. monocytogenes może występować we wszystkich rodzajach żywności, która nie była poddana specjalne obróbce. Szczególnie niebezpieczna jest żywność z długim terminem ważności przechowywana w niskiej temperaturze, która stwarza sprzyjające warunki do wzrostu Listerii. Mimo, że generalnie do wywołania listeriozy potrzebne są stosunkowo wysokie dawki niniejszego mikroorganizmu, to jednak nie należy zapominać, że w przypadku osób starszych czy kobiet w ciąży do infekcji może dojść po spożyciu żywności, w której jest niewielka liczba bakterii.
Firma bioMérieux, od lat współpracująca z największymi producentami żywności, zapewnia rozwiązania nie tylko do wykrywania Listerii czy innych patogenów, ale także wprowadza specjalne cyfrowe narzędzia statystyczne, umożliwiające przeciwdziałanie i wcześniejsze wykrywanie zagrożeń. Dzięki temu wspólnie możemy pomagać producentom chronić ich produkty oraz konsumentów.
Artykuł jest częścią opracowania - FoodFakty NAWIGATOR - Listeria w przemyśle spożywczym
