Wymogi CETA dla eksporterów żywności - Wymazy w kierunku patogenów z obszaru produkcji - załącznik (3)

W lipcu tego roku Health Canada opublikowała w TheCompendium of Analytical Methods, Volume 1, Part 6 - procedurę dotyczącą wprowadzania oraz zarządzania metodami badań mikrobiologicznych żywności w formie szczegółowego opracowania. Poniżej przedstawiamy Państwu załącznik do powyższego dokumentu: Załącznik 6.1 Przykłady MPN Liczenia Próbek ze Środowisk Powierzchni

Cześć pierwsza przewodnika: Wymogi CETA dla eksporterów żywności - Wymazy w kierunku patogenów z obszaru produkcji (1)

Przedmiot

Przedmiotem protokołu jest policzenie komórek Listeria monocytogenes  uzyskanych  z powierzchni środowiska z wykorzystaniem gąbek lub wymazówek. Protokół jest wykonany na podstawie  metody  najbardziej prawdopodobnej liczby (most probable number-MPN) z wykorzystaniem różnych podłoży agarowych, co pozwoli na bezpośrednią obserwację Listeria monocytogenes  z konkurującymi w tle mikroorganizmani takimi jak L. innocua.

Podsumowanie protokołu

Komórki uzyskane z badań powierzchni są dystrybuowane do dołków na płytce  96- dołkowej zawierające wzbogacone podłoże, Następuje inkubacja, małe porcje z każdego dołka są przenoszone na różne pożywki agarowe. Krople są umieszczone na powierzchni agaru z siatką kwadratów w powtórzeniach na płytkach 96-dołkowych. Po procesie inkubacji w kroplach zawierających  L.monocytogenes były obecne wyraźne formy wzrostu, łatwe do policzenia. Gatunki niedocelowe takie jak L. innocua , mogą wyrastać na agarze w różnej formie i kolorze co ułatwia rozróżnienie. Następnie może być wykorzystane oprogramowanie do wyliczenia najbardziej prawdopodobnej liczby (most probable number-MPN) w celu oszacowania liczby L. monocytogenes uzyskanej z powierzchni. Protokół jest właściwy dla koncentracji komórek L. monocytogenes w zakresie od 1 do 440 CFU/gąbkę lub wacik i jest adekwatny do typowej oceny próbek  koncentracji komórek z wysokiego poziomu.

Materiał i Metody

Komórki mogą być uzyskane zarówno z gąbek jak i wacików namoczonych w neutralizującym buforze. Następujący protokół wykonano na podstawie wykorzystania gąbek. Istnieje zamierzenie jako wytyczna, która może będzie musiała być modyfikowana w zależności od użytych zestawów do pobierania próbek i ich transportu. Przykład sugerowanej modyfikacji użycia wymazówek jest podany na końcu protokołu.

Posiew wgłębny na płytkach dołkowych

• Zadozuj wgłębnie 500 µL podwójnie stężonego UVM1 do każdego dołka z 96 wgłebień na płytce (Axygen, lub inny równoważy). Płytki te są cieńsze  niż zwykłe 96 dołkowe płytki i zawierają wyższą pojemność( sugerowane pojemność 2ml na dołek)
• Pobierz próbkę z testowanego obszaru z wykorzystaniem odpowiednio zmoczonej w neutralizującym buforze gąbki. Gąbkę włóż  do plastikowej torebki, z której ją wyjęto lub nowej sterylnej.
• Oceń ilość buforu, który może być uzyskany z wyciśniętej gąbki. Ilość ta może być nieznacznie mniejsza niż ilość buforu, w którym zamoczono gąbkę ( np.  gąbki zamoczonej w 10 ml buforu uzyskuje się 7-8 ml płynu). Dodaj  wystarczającą ilość sterylnej wody peptonowej do sterylnej torebki, aby uzyskać ilość 50 ml ( biorąc pod uwagę ilość przypuszczalnie odzyskanego buforu z gąbki).
• Przetrzymaj gąbkę przez 30 sek. w celu uwolnienia komórek
• Chwycić gąbkę przez worek i ciśnij, aby uzyskać taką ilość płynu jaka jest możliwa. Wyrzuć gąbkę.
• W tym punkcie użyteczne jest przeniesienie płynu do sterylnej 50 ml probówki z zamknięciem lub innego odpowiedniego pojemnika. Nie jest to konieczne, ale daje możliwość uprzedzenia następnego kroku. 

• Nanieść 500 µL zawiesiny komórek do każdego z 96  dołków na płytce . Jeżeli ilość zawiesiny jest niewystarczająca do wypełnienia wszystkich wgłębień, zanotuj liczbę wgłębień aktualnie użytych.
• Zamknij płytkę i zaklej parafilmem w celu uniknięcia parowania , a następnie inkubuj w temp. 30 °C przez 48 ± 4godz.

Transfer na podłoża Agarowe selektywne/Różnicujące

• Przygotuj Rapid L mono agar ( Biorad lub inny odpowiednik)  na płytkach Petriego o wymiarach  120mm x120mm (Coming/Gosselin lub inny odpowiednik).

• Wykorzystując wielokanałową pipetę, przenieś 5µL z każdego wgłębienia 96 dołkowej płytki na powierzchnię agarową RLM. Ostrożnie powtarzaj tę czynność; krople powinny tworzyć odrębne punkty  na powierzchni agaru i nie powinny do siebie dotykać. Pozostaw płytki w pozycji pionowej do momentu, aż płyn zostanie zaabsorbowany przez agar, następnie inkubuj próbkę w 37 °C przez 48 ± 4godz.

• Płytki mogą zostać odczytane po 24 gadzinach inkubacji, ale plamki ze zmieszanymi gatunkami (np. monocytogenes and L. innocua) będą potrzebowały 48 godzin do rozwoju i osiągnięcia oczywistego niebieskiego koloru.
• Obserwuj płytki i zanotuj wyniki ; błękitne plamki są uważane za domniemane monocytogenes; zaś plamki w innym kolorze za organizmy konkurujące (np. L. innicula tworzy białe plamki )
• Mogą występować również plamki zawierające dwa lub więcej gatunków. Gdy jest obecna monocytogenes kolor błękitny będzie wciąż widoczny, choć w jaśniejszym odcieniu; zanotuj te plamki jako domniemane dla                  L. monocytogenes

Wykorzystaj liczbę błękitnych plamek ( czystych i mieszanych) oraz całkowitą liczbę dołków zaszczepionych ( 96 lub mniej w przypadku gdy ilość materiału była niewystarczająca) w celu policzenia MPN  L. monocytogenes uzyskanej z badanej powierzchni.  Wzór do obliczenia MPN znajduje się tutaj:

http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm) 

wzór ten w formie uproszczonej jest następujący:

MPN per test area= −ln (1−p/n)×n

p- liczna pozytywnych (niebieskich punktów)

n- liczba wgłębień w metodzie wgłębnego posiewu na  płytki z wgłębieniami  ( 96 lub mniej)

Modyfikacja w przypadku użycia wacików

Stosowane wymazówki są  zazwyczaj w probówkach  zawierających 1 mL neutralnego buforu do zmoczenia wacików. Po pobraniu wymazu  protokół może być dostosowany i może być wzięta pod uwagę mniejsza wielkość wacika i ilość płynu.

Sugerowane modyfikacje obejmują:

• Użyj sterylnych nożyczek do odcięcia końcówki wymazówki i włożenia do sterylnej probówki zawierającej  5ml UVM1
• Mieszaj energicznie
• Dodaj 15 ml UVM1(o pojedynczej mocy) uzupełnij do ilości docelowej 20 ml.
• Przenieś 200 µL do każdego wgłębienia na 96 dołkowej płytce
• Zwyczajna 96 dołkowa płytka może być wykorzystana na tym etapie  w celu redukcji ilości materiału.
• Wszystkie inne kroki są opisane powyżej