Wymogi CETA dla eksporterów żywności - Wymazy w kierunku patogenów z obszaru produkcji (2)

W lipcu tego roku Health Canada opublikowała w TheCompendium of Analytical Methods, Volume 1, Part 6 - procedurę dotyczącą wprowadzania oraz zarządzania metodami badań mikrobiologicznych żywności w formie szczegółowego opracowania.

Od redakcji: Na rynkach Ameryki Północnej badania ukierunkowane na środowisko produkcji (szczególnie wymazy w kierunku bakterii patogennych) w dużo większym stopniu są podstawą spełnienia wymogów systemów bezpieczeństwa żywności niż w UE. Mogą to potwierdzić wszyscy polscy producenci już eksportujący na te rynki i mający okazję być poddanym np. inspekcji służb USDA. Również w UE można zaobserwować rosnące znaczenie monitoringu środowiska produkcyjnego w korelacji do badań gotowych produktów. 

Cześć pierwsza przewodnika: Wymogi CETA dla eksporterów żywności - Wymazy w kierunku patogenów z obszaru produkcji (1)

Zapraszamy do zapoznania się z 2 częścią przewodnika:

4. Pośrednia walidacja- Opracowanie Metod Porównawczych

Ten rozdział przedstawia w skrócie wskazówki dotyczące opracowania metod porównawczych, w których alternatywne metody są porównane z akceptowalnymi metodami referencyjnymi. Ogólnie parametry metod zawierające czułość, specyfikę, wyniki fałszywe zarówno negatywne jak i pozytywne, a także skuteczności są oceniane na podstawie ogólnych danych wygenerowanych dla wszystkich środowisk powierzchni, które są oceniane.

Opracowanie metod porównawczych musi zawierać, co następuje:

• Surowe dane i streszczenia
• Prawdopodobieństwo wykrycia
• Parametry użytkowe
• Kompletna dokumentacja i opisy wszystkich protokołów (w tym ustnych) wykorzystywanej w czasie opracowania walidacji

Dodatkowe wytyczne dotyczące tworzenia opracowania znajdują się w Part 4, “Guidelines for the Relative Validation of Indirect Qualitative Food Microbiological Methods” from the Compendium of Analytical Methods.

4.1 Środowisko Powierzchni

Opis środowisk  powierzchni tak dokładny jak to tylko możliwe do sprawdzenia np. typ 316 stal nierdzewna przeznaczona do kontaktu z żywnością.

MMC ( Microbiology Methods Committee) oceni wniosek dotyczący zastosowania różnych środowisk powierzchni jeżeli pakiet sprawdzający będzie zawierał  co najmniej dane dla stali nierdzewnej, plastiku, ceramiki, plus dwa dodatkowe środowiska powierzchni, które spełniają wymagania MMC.

4.2 Zestawy do pobierania próbek bakterii

Należy szczegółowo opisać zestawy do pobierania wymazów/ narzędzia do pobierania próbek ( np. gąbki wymazówki, próbki), które będą wykorzystywane. Wszystkie narzędzia  powinny być testowane w kierunku właściwości inhibitujących przeciwko docelowym szczepom  bakterii  z wykorzystaniem metodyki Llabrés and Rose, 1989, Daley et al., 1995, lub innej akceptowalnej metody akceptowalnej przez MMC. 

4.3 Środki Zwilżające

Środowisko powierzchni w produkcji żywności jest czyszczone/dezynfekowane regularnie. Tego typu próbki środowiskowe według MFLP-41 wymagają stosowania powierzchni z neutralizatorami i lub czynnikami neutralizującymi we wcześniejszych próbkach, ponieważ stosowane substancje czyszczące/sterylizujące mogłyby mieć wpływ zarówno na mikroorganizmy w próbce, jak również na stosowaną metodę analizy. Dlatego też przewiduje się opracowanie środków zwilżających, które będą wykorzystywane.  Appendix 2 z  MFLP-41wykazuje zazwyczaj stosowane neutralizatory oraz składniki neutralizujące. W przypadku chronionego patentem, zmodyfikowanego lub nowego środka zwilżającego należy złożyć jego skład, składniki zneutralizowane i dowody efektywności ( cel mikrobiologiczny może być  wykryty i wyizolowany z wysterylizowanego środowiska powierzchni po użyciu substancji neutralizującej). Dowód efektywności może być ustalony eksperymentalnie np., Dey and Engley, 1995.  Jest to zalecane w celu sprawdzenia wielu środków zwilżających.

Te środki zwilżające, które są sprawdzone i potwierdzone przez MMC będą umieszczone na liście do wykorzystania w metodyce.

4.4 Selekcjonowanie szczepów

Preferowane jest wykorzystanie szczepów bakterii wyizolowanych z żywności, środowiska przetwarzania żywności lub  próbki wyizolowane w warunkach klinicznych, związane z powstaniem chorób, których źródłem jest żywność. Rodzaje szczepów lub szczepy referencyjne z kolekcji hodowli powinny być zawarte jeżeli są osiągalne. Dla gatunku (np. listeria spp.), szczepu reprezentującego różne gatunki powinien być wybrany odpowiedni poziom metodyki. Jeżeli to możliwe należy używać różnorodne odmiany, szczepy, serotypy, genotypy, gatunki. Wykorzystuje się  jeden szczep przez cykl i minimum 3 różne szczepy w trakcie oceny walidacyjnej.

Według alternatywnej metody referencyjnej przewidywane jest, w oparciu o wyniki, uzyskanie  krzywej wzrostu szczepów na wzbogaconym podłożu płytkowym z bulionem. Minimalnie trzy krzywe powinny być opracowane w trakcie całego okresu inkubacji alternatywnej lub referencyjnej metody inkubacji, którakolwiek jest dłuższa.

Liczba punktów czasowych powinna odzwierciedlać czas trwania  inkubacji i stanowi sugestię rozpoczęcia zaszczepienia próbki jest 10-100 FCU.

4.5 Liczba próbek

Liczba próbek wymaganych dla każdego środowiska powierzchni wynosi 40 próbek na niskim poziomie inokulacji, 5 próbek na wysokim poziomie inokulacji ( ok. 10-100x niski poziom) , 5 niezaszczepionych próbek kontrolnych. Niski poziom inokulacji powinien uzyskać ok. 50% ( w zakresie 25-27%) pozytywnych efektów zarówno w metodzie referencyjnej jak i alternatywnej.

Minimalny zbiór danych wymagany w zgłoszeniu wynosi 3 środowiska powierzchni. Mogą one składać się z trzech powtórzeń dla danego środowiska i z trzech powtórzeń dla różnych środowisk powierzchni. Minimalna liczba pozytywnych wyników musi być na poziomie 60, z których co najmniej 45 musi pochodzić z niskiego poziomu. Zaleca się stosowanie w celu sprawdzenie licznych środków zwilżających i zestawów do pobierania i transportu materiału w trakcie opracowywania badań.  Zaleca się jeden rodzaj zestawu do pobierania próbek oraz jeden czynnik zwilżający w trakcie cyklu.

4.6  Zakłócenia / Organizmy w Tle

Inokulacja wszystkich środowisk powierzchni zawierających mieszaninę co najmniej 2 zakłócających organizmów stosuje się docelowo na poziomie co najmniej  10x większym niż występujący  w środowisku żywności i produkcji żywności.

Wybór tła mikroorganizmów jest zalecany w celu odzwierciedlenia środowiska produkcyjnego. Co najmniej 2  szczepy powinny być szczepami zakłócającymi. Pełna dokumentacja powinna zawierać  informacje dotyczące  wykorzystanych szczepów, przygotowania i inkubacji próbek.

W celu wyselekcjonowania organizmu zakłócającego (interferującego), organizm powinien:

•  Przetrwać w/na testowanej matrycy: regenerować się (aklimatyzować) na suchej powierzchni i wykazywać wzrost na podłożu selektywnie lub nieselektywnie wzbogaconym ( w celu udowodnienia, że organizm może funkcjonować w środowisku powierzchni).

• Wzrost w systemie wzbogaconym ( nawet jeżeli jest on limitowany) w metodzie alternatywnej (np. wzrost w BHI, przeniesienie 100µl do wzbogaconego bulionu, a następnie obserwacja wzrostu zmętnienia pożywki) lub zakłócenia z inną porcją w przypadku metody alternatywnej.

Przewiduje się uzasadnienie, zawierające informacje jak wyżej, co do wyboru organizmów zakłócających i znajdujących się w tle w waszym pakiecie walidacyjnym (sprawdzającym).

Mogą być wymagane dodatkowe informacje dotyczące krzywej wzrostu.

 *Wykorzystanie tych mikroorganizmów jest obligatoryjne do uzyskania  celu. Dodatkowe mikroorganizmy mogą być wyselekcjonowane jako  organizmy zakłócające/ stanowiące tło.

Metody alternatywne  muszą być co najmniej równocenne z referencyjnymi w wykrywaniu organizmów docelowych w przypadku obecności organizmów zakłócających.

4.7 Procedura Wzbogacania

Próbka środowiska powierzchni powinna być zdezynfekowana lub wysterylizowana przed użyciem. Należy przygotować szczepionkę (inokulum) zawierającą mikroorganizmy docelowe, zakłócające i stanowiące tło oraz pożywki.  Wykonuje się  dodatkowo 5 próbek na wysokim poziomie ( do wykorzystania w rozdziale 4.8).

Należy zastosować  małe ilości i wysuszyć przez co najmniej 18-24 godzin lub dłużej jeżeli jest to wymagane, aż do momentu widocznego wysuszenia, w warunkach kontrolowanej temperatury i wilgotności. Należy zanotować temperaturę, wilgotność i czas suszenia w dokumentach zgłoszeniowych.

Inokulum (szczepionka) powinno być ocenione ilościowo przed i po suszeniu. Bezpośredni posiew na płytkę lub inne rozwiązanie może być wykorzystane w celu policzenia inokulum przed suszeniem. Zob. Rozdz. 4.8 – Liczenie  próbek po  suszeniem.

4.8 Liczenie  próbek po suszeniu

Akceptowalne podejście zawiera:

• MPN z wysokiego poziomu inokulacji  wykonane na podstawie  odpowiedniej metody referencyjnej z ekstrapolacją niższego poziomu inokulacji. Zob. załącznik 6.1
• Hydrofobowy filtr membranowy  (Hydrophobic Grid-Membrane Filter – HGMF) filtracja z regeneracją membrany
• Rozpylenie próbki na filtr membranowy z możliwością regeneracji

Dla niektórych organizmów docelowych liczenie powinno być wykonane w obecności organizmów stanowiących tło/ zakłócających. Jeżeli nie można tego osiągnąć to policzenie organizmów docelowych będzie również akceptowalne: po uzasadnieniu takiego podejścia.

Posiew bezpośredni na płytkę i obecność/nieobecność metod nie może być wykorzystana do policzenia inokulum na powierzchni środowiska w czasie badania.

4.9 Procedura Pobierania Próbek

 Pobieranie próbek środowiskowych powinno być przeprowadzone według MFLP-41. Po pobraniu zestawy do pobierania i transportu próbek powinny być przetrzymane w chłodniczych warunkach przez minimum 24 godziny.

4.10 Procedura Potwierdzenia

Potwierdzenie kultur przypuszczalnych wyników dla  par powiązanych i niepowiązanych musi być potwierdzone w sposób jaki jest opisany w Annex 4.3Experimental Layout for the Validation of Indirect Qualitative Microbiological Methods.

Dla próbek niepowiązanych według alternatywnej metody zalecono pełną procedurę, zawierającą procedurę potwierdzającą, która musi być sprawdzona. W dodatku oddzielna ścieżka musi być sprawdzona, z częścią wzbogaconej metody alternatywnej, jest skierowana  do metody referencyjnej na wcześniejszym etapie (zał.4.3), zawierającej wzbogacone buliony (podłoża) z metody referencyjnej jako właściwe. Minimum, w przypadku oddzielnej ścieżki, całkowity czas inkubacji na podłożu wzbogaconym według metody alternatywnej musi uzyskać minimalny czas inkubacji całkowitego wzbogacenia ( pierwotnego i powtórnego podłoża)  według referencyjnej metody hodowli. Oddzielny raport wyników ze wszystkimi potwierdzeniami wykorzystanymi w opracowaniu walidacyjnym.

5. Włączenia /Wyłączenia i Transfer badań

Włączenia/Wyłączenia i transfer badań  są wymagane i powinny być przeprowadzone według części 4.

W kolejnej części Załącznik 6.1 do powyższego przewodnika Przykłady MPN Liczenia Próbek ze Środowisk Powierzchni, a w nim: Podsumowanie protokołu, omówinie Materiałów i Metod, Posiew wgłębny na płytkach dołkowych oraz Transfer na podłoża Agarowe selektywne/Różnicujące

Czytaj dalej: Załącznik 6.1 Przykłady MPN Liczenia Próbek ze Środowisk Powierzchni