Analizy mikrobiologiczne żywności oraz poprawnie skonstruowany plan monitorowania środowiska produkcyjnego stanowią podstawę dla skutecznych i dobrze działających systemów bezpieczeństwa w przemyśle spożywczym. Obecność niepożądanych mikroorganizmów, w tym zarówno mikrobiologicznych wskaźników jakości jak i drobnoustrojów chorobotwórczych, przyczyniła się do wykonywania rutynowych analiz mikrobiologicznych żywności oraz środowiska, w którym żywność jest wytwarzana. Celem tych badań jest weryfikacja stanu sanitarnego oraz zapewnienie jak najwyższej jakości i bezpieczeństwa zdrowotnego produkowanych środków żywnościowych.

Rutynowe analizy mikrobiologicznych wskaźników jakości w przemyśle spożywczym obejmują przede wszystkim ilościowe oznaczanie: ogólnej liczby bakterii tlenowych, drożdży i pleśni, Escherichia coli (E. coli) oraz bakterii grupy coli. W tym celu powszechnie i od wielu lat stosowane są tradycyjne metody mikrobiologiczne, polegające na wykorzystaniu stałych podłóż hodowlanych (agarowych). Tradycyjne techniki badawcze oparte na podłożach agarowych są jednak pracochłonne i wieloetapowe, często niosąc ze sobą liczne ograniczenia dla użytkownika metody, takie na przykład jak:

• duży nakład pracy, uwzględniający m.in. etap przygotowania, sterylizacji, kontroli jakości wytwarzanych podłoży mikrobiologicznych dla każdego badanego parametru,
• długi czas sterylizacji podczas produkcji znacznych objętości pożywek,
• zmienność pomiędzy wytwarzanymi partiami i cyklami sterylizacji podłoży agarowych w danym laboratorium,
• czasochłonność w przypadku przygotowania pożywek zawierających nietrwałe termicznie składniki, które wymagają np. gotowania przez określony czas pod stałym nadzorem,
• ryzyko niekontrolowanych zmian pH i barwy pożywek, zmienna żyzność czy też zmniejszony odzysk drobnoustrojów z powodu np. obecności toksycznych produktów ubocznych reakcji Maillarda (w przypadku podłoży zawierających cukry redukujące),
• wydłużone czasy inkubacji, odczytu oraz interpretacji wyników.

W ostatnich latach doszło do intensywnego rozwoju alternatywnych rozwiązań badawczych w mikrobiologicznej analizie żywności. Z tego powodu portfolio gotowych do użycia płytek 3M™ Petrifilm™ zostało wzbogacone i rozszerzone o innowacyjną linie testów mikrobiologicznych - 3M Petrifilm Rapid - umożliwiających przeprowadzenie szybkich ale nadal dokładnych analiz mikrobiologicznych wskaźników jakości w przemyśle spożywczym. Płytki 3M Petrifilm z serii Rapid zostały bowiem zaprojektowane w celu zwiększenia produktywności oraz wydajności laboratoriów badających różne próbki pochodzące z sektora spożywczego, ułatwiając odczyt i interpretację płytek oraz skracając czas do uzyskania wyniku analizy. Ponadto, wykorzystując automatyczny licznik kolonii 3M Petrifilm Plate Reader Advanced istnieje również możliwość usprawnienia zliczania i interpretacji płytek 3M Petrifilm w każdym laboratorium mikrobiologicznym.

Najczęściej badane mikroorganizmy wskaźnikowe w przemyśle spożywczym i związane z nimi płytki 3M Petrifilm z serii Rapid opisano poniżej w dalszej części artykułu.

Ogólna liczba bakterii tlenowych

Bakterie tlenowe są grupą drobnoustrojów powszechnie bytujących w powietrzu, glebie i rozkładającej się materii organicznej, które pełnią istotną funkcje w przyrodzie oraz gospodarce człowieka. W przemyśle spożywczym, mezofilne bakterie tlenowe (tzn. rosnące w umiarkowanych zakresach temperatury, tj. 20-45° C) są oznaczane jako parametr ogólna liczba drobnoustrojów (OLD). Parametr ten jest jednym z najczęściej wykonywanych testów w mikrobiologii żywności, który niesie ze sobą istotne informację na temat ogólnej oceny jakości mikrobiologicznej żywności oraz środowiska jej wytwarzania.  

Konwencjonalne metody badawcze dla parametru ogólnej liczby drobnoustrojów są oparte na standardowych podłożach mikrobiologicznych, tj. agar PCA (ang. Plate Count Agar) i/lub agar PCA z odtłuszczonym mlekiem (mPCA), zaś wyniki analizy dla tych metod są dostępne dopiero po 48-72 godzinach inkubacji. Płytki 3M Petrifilm Rapid Aerobic Count (RAC), służące do szybkiego oznaczania ogólnej liczby bakterii tlenowych, umożliwiają wydanie wyniku analizy zaledwie po 24 godz. inkubacji dla różnych matryc żywnościowych. Jest to możliwe m.in. dzięki zastosowaniu w płytkach 3M Petrifilm RAC wzbogaconego składu substancji odżywczych oraz opatentowanej technologii barwienia kolonii bakterii z wykorzystaniem wielu wskaźników chromogennych, barwiących kolonie w różnych odcieniach koloru czerwonego i niebieskiego. Wspomniana technologia jest oparta na aktywności metabolicznej i enzymatycznej drobnoustrojów, dzięki której możliwa jest lepsza i szybsza wizualizacja pojedynczych kolonii bakterii, a co za tym idzie, ulepszone zliczanie i interpretacja płytek.

Kolonie na płytce 3M Petrifilm RAC do szybkiego oznaczania ogólnej liczby bakterii tlenowych można zliczać manualnie, pod urządzeniem powiększającym, lub przy użyciu automatycznego licznika kolonii. Podczas odczytu wyniku należy zliczyć wszystkie kolonie niezależnie od koloru, wielkości i intensywności barwy. Istnieje również możliwość ewentualnej izolacji wybranych kolonii bakterii w celu dalszych analiz i identyfikacji.

Drożdże i pleśnie

Istotną grupą drobnoustrojów w przemyśle spożywczym są grzyby, które z praktycznego punktu widzenia zostały podzielone na drożdże i pleśnie. Badania dotyczące mykologicznej analizy żywności są ważnym elementem oceny jakości środków spożywczych, w szczególności w kontekście psucia żywności oraz prognozowania okresu przydatności do spożycia. Drożdże i pleśnie są bowiem zdolne do wzrostu i rozwoju w żywności w stosunkowo niskich temperaturach (25-32° C) oraz w środowisku o niskiej kwasowości (pH 4-5 lub niższym). Podczas wzrostu drożdże i pleśnie wykorzystują niektóre składniki żywności (np. cukry, kwasy organiczne), wydzielając końcowe produkty metabolizmu (w tym metabolity wtórne), które mogą przyczyniać się np. do sensorycznych zmian żywności lub umożliwiać rozwój szkodliwej mikroflory bakteryjnej (np. bakterii gnilnych).  

Zróżnicowana natura drożdży i pleśni przyczyniła się do opracowania i wykorzystywania wielu różnych podłoży agarowych w celach analitycznych żywności. W ten sposób powszechnie stosowane metody agarowe bazują na różnych mediach hodowlanych (np. agar z chloramfenikolem – YGC lub agar DG-18), zaś czas inkubacji dla klasycznych metod jest długi i wynosi od 5 nawet do 14 dni. W przeciwieństwie do klasycznych podłóż agarowych, płytki 3M Petrifilm Rapid Yeast and Mold (RYM), do szybkiego oznaczania drożdży i pleśni, umożliwiają wydanie wyniku analizy już w ciągu 48-72 godz. inkubacji. Płytki 3M Petrifilm RYM są gotowe do użycia, zawierają niezbędne składniki odżywcze, antybiotyki oraz rozpuszczalny w zimnej wodzie czynnik żelujący. Dzięki wykorzystaniu opatentowanej technologii, płytki 3M Petrifilm RYM znajdują zastosowanie w analizie bardzo szerokiej gamy środków spożywczych oraz wymazów środowiskowych. Ponadto, płytki te mogą być wykorzystywane do analizy produktów zarówno o wysokiej jak oraz obniżonej aktywności wody (A_w).

W płytkach 3M Petrifilm RYM zastosowano unikatowy system wskaźników chromogennych, który umożliwia lepszą wizualizacje i rozróżnienie kolonii drożdży i pleśni. Drożdże rosną bowiem w postaci małych, wypukłych kolonii, o wyraźnie zaznaczonych brzegach w jednolitym kolorze od opalizująco-różowego do niebiesko-zielonego. Natomiast, pleśnie  tworzą duże i płaskie kolonie z ciemnym centralnym ogniskiem, o rozmytych brzegach w kolorze zazwyczaj niebiesko-zielonym lub ciemniejszym (w zależności od gatunku).

E. coli i bakterie grupy coli

Bakterie E. coli oraz inne rodzaje bakterii należące do szerzej definiowanej grupy coli (np. Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter) to parametry powszechnie wykorzystywane jako wskaźniki jakości oraz higieny zarówno żywności jak i wody. Bakterie te należą do rodziny Enterobacteriaceae, są tlenowcami lub względnymi beztlenowcami i występują powszechnie w środowisku naturalnym, wodzie, glebie oraz w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt stałocieplnych. Bakterie grupy coli są wrażliwe na większość procesów obróbki termicznej żywności (np. pasteryzacja). W związku z tym, obecność tych bakterii w żywności poddanej obróbce termicznej może sugerować, że dany proces technologiczny został przeprowadzony niepoprawnie lub wskazuje na potencjalne wtórne zanieczyszczenie produktu np. w środowisku wytwarzania żywności.

E. coli oraz pozostałe bakterie należące do grupy coli są zazwyczaj zdolne do fermentacji laktozy przy jednoczesnym wytworzeniu kwasu i aldehydu. Standardowe metody badawcze dla tych parametrów analitycznych są oparte na klasycznych podłożach agarowych i nierzadko wymagają etapu potwierdzenia, np. wytwarzania gazu, co skutkuje koniecznością stosowania różnych mediów hodowlanych oraz wydłuża czas do uzyskania wyniku analizy nawet do 48 godz. inkubacji.

Unikalna konstrukcja płytek 3M Petrifilm umożliwia jednoczesne wykrywanie i ilościowe oznaczenie tej grupy drobnoustrojów na podstawie aktywności enzymatycznej w tym zdolności do fermentacji laktozy. Dzięki zastosowaniu płytki 3M Petrifilm Rapid Coliform (RCC), służącej do szybkiego oznaczania bakterii grupy coli, możliwe jest wczesne ostrzeżenie o kontaminacji produktu lub środowiska przetwarzania żywności tą grupą bakterii zaledwie w ciągu 6-14 godzin inkubacji z potwierdzonym pozytywnym wynikiem w ciągu 24 godzin.

Wzrost bakterii grupy coli na powierzchni płytki 3M Petrifilm RCC następuje w postaci utworzenia charakterystycznych, czerwonych kolonii z żółtymi otoczkami. Do zmiany barwy żelu dochodzi w skutek wytwarzania kwasu przez bakterie grupy coli, zaś żółte otoczki mogą pojawić się już po 6 godzinach inkubacji. Dzięki zamkniętej strukturze płytek 3M Petrifilm, możliwa jest również wizualna obserwacja zdolności bakterii do wydzielania gazu, która uwidaczniana jest w postaci obecności pęcherzyków gazu tuż przy koloniach bakterii.

Dodatkowo portfolio płytek 3M Petrifilm zostało poszerzone o parametr 3M Petrifilm Rapid E.coli/Coliform (REC), który służy do szybkiego i jednoczesnego oznaczania E. coli oraz bakterii grupy coli w tym samym czasie na jednej płytce. Technologia zastosowana w płytce 3M Petrifilm REC jest oparta m.in. na zdolności bakterii grupy coli do fermentacji laktozy przy jednoczesnym odróżnieniu typowych bakterii E.coli, wytwarzających enzym ß-glukoronidazę. Zastosowanie podwójnego wybarwiania kolonii bakterii dla dwóch parametrów badawczych skutkuje uzyskaniem zielonej barwy kolonii E. coli oraz czerwonych kolonii dla pozostałych bakterii grupy coli. Istnieje również możliwość wizualizacji kolonii wytwarzających gaz, zaś czas inkubacji dla płytki 3M Petrifilm REC wynosi 18-24 godz., zarówno dla parametru E. coli jak również bakterii grupy coli. 

Certyfikaty i walidacje

Wiarygodność i dokładność płytek 3M Petrifilm Rapid została potwierdzona licznymi walidacjami niezależnych jednostek certyfikujących o zasięgu międzynarodowym, np.: AOAC^® International, MicroVal oraz NF Validation (AFNOR). Ponadto, walidacje jednostek MicroVal oraz AFNOR Validation zostały wykonane zgodnie z protokołem technicznym opisanym w standardzie ISO 16140-2:2016 w odniesieniu do powszechnie stosowanych metod referencyjnych, w tym metod wymienionych w załączniki I Rozporządzenia Komisji WE nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych środków spożywczych. Metoda 3M Petrifilm spełnia zatem wszystkie wymogi i kryteria zawarte w/w Rozporządzeniu odnośnie wykorzystania alternatywnych metod analitycznych, a co za tym idzie, może być swobodnie stosowana przez wszystkie laboratoria kontrolujące i badawcze.

W przypadku pojawienia się dodatkowych pytań, serdecznie zachęcamy do bezpośredniego kontaktu (e-mail: santon@mmm.com). Będzie Nam bardzo miło porozmawiać z Państwem osobiście i wspólnie omówić poruszone zagadnienia.