We współczesnych czasach świadomego konsumpcjonizmu, producenci żywności stawiają bardzo duże wymagania w przestrzeni higieny środowiska produkcyjnego. Rynek odpowiada na ich wymagania, proponując różne metody weryfikacji stanu czystości. Monitoring higieny w przemyśle spożywczym możemy przeprowadzić m.in. poprzez inspekcję wizualną, możemy także badać pod kątem zanieczyszczenia mikrobiologicznego, przy użyciu podłóż mikrobiologicznych, lub używając szybkich testów sprawdzających pozostałości organiczne i kontaminację mikrobiologiczną. Coraz częściej używane są szybkie testy, ponieważ pozwalają na wiarygodną ocenę stanu czystości w krótkim czasie. Powszechnie znaną i używaną metodą w tej kategorii jest użycie bioluminescencji do oznaczania ATP (adenozynotrifosforan).

Metoda bioluminescencji, której użycie zastosowano w przemyśle spożywczym  została opisana już w latach 80. ubiegłego wieku[1]. Stosuje się ją do wykrywania pozostałości organicznych i zanieczyszczeń mikrobiologicznych poprzez wykrywanie obecności ATP na badanej powierzchni bądź w popłuczynach. ATP jest to związek chemiczny występujący we wszystkich komórkach żywych, pełniąc funkcję nośnika energii.

Zasada metody oparta jest na prostym mechanizmie reakcji enzymatycznej z użyciem lucyferyny i ATP jako substratu, lucyferazy jako enzymu oraz katalizatora jakim są jony magnezu. Produktem ubocznym reakcji jest światło (RLU, relative light unit), które wychwytywane przez system detekcji luminometru (urządzenia stosowanego w tej metodzie) jest wskaźnikiem poziomu zanieczyszczenia badanej powierzchni lub popłuczyn.

Mimo, iż metoda jest obecna w przemyśle spożywczym już wiele lat, jej zastosowanie lub aplikacja niejednokrotnie może wydawać się niejasna lub zastanawiająca. Czy luminometr może określić poziom alergenów lub zanieczyszczenie wirusami? Czy należy ustalać nowe poziomy detekcji przy zmianie urządzenia? Informacje zawarte w poniższym tekście powinny pomóc w znalezieniu odpowiedzi na te i inne pytania.

Zanieczyszczenie ATP jest jednoznaczne z zanieczyszczeniem mikrobiologicznym. MIT

Cząsteczka ATP jest zawarta we wszystkich komórkach żywych mikroorganizmów takich jak bakterie czy pleśnie, ale także w komórkach somatycznych. Zatem powierzchnia bądź popłuczyny, w których zostało wykryte ATP może być kontaminowana, ale niekoniecznie mikrobiologicznie. Co więcej poziom zanieczyszczenia ATP nie wpływa na wielkość zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Zawartość ATP w komórkach znacząco się różni, i tak np. w Escherichia coli występuje 1 fg ATP/komórkę a w Saccharomyces cerevisiae jest 155 fg ATP/komórkę. Nie jest zatem możliwe ustalenie korelacji pomiędzy wartością ATP a wartością JTK (jednostki tworzące kolonię) na danej powierzchni czy w popłuczynach. Natomiast należy koniecznie pamiętać, że powierzchnia, na której znajdują się zanieczyszczenia organiczne stanowi idealne miejsce do namnażania się flory bakteryjnej np. tej zawartej w opadającym na nieczystą powierzchnie powietrzu. Mimo, iż w danym momencie nie wykryto kontaminacji mikroorganizmami, chwilę później na tejże brudnej powierzchni może znaleźć pożywienie wiele drobnoustrojów[2]. Można by rzec, że weryfikacja czystości metodą pomiaru ATP jest krokiem przed zanieczyszczeniem mikrobiologicznym.

Pomiar luminometryczny prowadzony w innej temperaturze niż pokojowa, może być zaburzony. PRAWDA

Każda reakcja enzymatyczna zależna jest od temperatury. W przypadku reakcji ATP z lucyferyną oraz lucyferazą optymalna temperatura reakcji jest relatywnie niska, bliska temperaturze pokojowej i jest stosunkowo odporna na wahania temperaturowe. Inaczej jest niejako z samymi składnikami reakcji: lucyferyną i lucyferazą. Najczęściej składniki reakcji stają się niestabilne powyżej temp. 30 st. C. Dlatego ważne jest, żeby tak zaprojektować składniki reakcji, aby były one maksymalnie stabilne podczas wahań temperaturowych, a dzięki temu wyniki były wysoce powtarzalne[3].

Współczynnik zmienności pomiaru w różnych temperaturach (współczynnik zmienności pomiaru, nie powinien być wyższy niż 20%)

Przy pomocy luminometru możemy określić kontaminację alergenami lub wirusami. MIT

Zgodnie z wcześniejszymi informacjami luminometr wykrywa ATP, a ATP zawarte jest we wszystkich komórkach. Alergeny są to białka, które wywołują reakcję immunologiczną, nie zawierają ATP, nie mogą być zatem wykrywane metoda bioluminescencji. Niemniej jednak alergeny mogą być związane z komórkami somatycznymi, jak np. białko mleka zawarte w produktach mleczarskich, w takim wypadku będziemy w stanie określić zanieczyszczenie na poziomie ATP, ale nie pochodzące bezpośrednio z alergenu, lecz z materiału organicznego. Określenie zatem, że metoda ATP jest stosowana do wykrywania obecności lub poziomu alergenów, jest dalekie prawdy. Podobnie jest z wirusami. Wirusy są to twory zbudowane z materiału genetycznego otoczonego białkową powłoką. Nie są organizmami żywymi, nie wykazują metabolizmu, poza organizmem żywiciela nie są w stanie funkcjonować. Wirusy nie wytwarzają ATP zatem metodą bioluminescencji nie jesteśmy w stanie ich wykryć.

Wprowadzając metodę wykrywającą ATP do zakładu należy samodzielnie ustanowić dopuszczalne progi wartości. PRAWDA

Wykorzystanie luminomertu nie tylko pozwoli nam na określenie poziomu ATP na badanej powierzchni czy w popłuczynach, ale powinno dać informację czy powierzchnia jest bezpieczna do dalszego użytku. W tym celu wprowadzając metodę pomiaru ATP w swoim zakładzie produkcyjnym należy ustalić poziomy ATP, dzięki którym będziemy mogli kwalifikować uzyskane wyniki. Co więcej, wprowadzając urządzenie innego producenta, a co za tym idzie inaczej skonstruowane, z innym układem optycznym należy taką weryfikację progów ATP przeprowadzić na nowo. Należy zacząć od ustalenia poziomu tła samego urządzenia. Powinno ono wynosić kilka do kilkunastu jednostek RLU (ang. relative light unit), wtedy mamy pewność, że zarówno urządzenie jak i testy działają poprawnie. Każdy próg ATP powinien być ustalany indywidualnie dla danego punktu pomiarowego, chyba że punkty są zbliżone np. miejscem występowania, materiałem wykonania (np. stal nierdzewna). Pomoc w kwalifikacji progów na dane punkty pomiarowe z pewnością może zapewnić odpowiednie oprogramowanie. I tak w systemie 3M™ Clean-Trace™ za pomocą raportu trendów można ustalać i korygować bezpieczne dla danego miejsca poziomy ATP (dopuszczalne, pozytywne/niedopuszczalne, awarie).

Wystarczy zdezynfekować powierzchnię, aby była czysta i wolna od ATP. MIT

W celu utrzymania powierzchni produkcyjnych w czystości należy je systematycznie myć przy użyciu urządzeń myjących z odpowiednimi środkami chemicznymi, a następnie dezynfekować w celu zabezpieczania powierzchni przed rozwojem drobnoustrojów. Sam proces dezynfekcji na zabrudzonej powierzchni nie skutkuje uzyskaniem czystej powierzchni, wolnej od zabrudzeń organicznych, a co za tym idzie zanieczyszczeń ATP[4]. Z nieumytej a zdezynfekowanej powierzchni uzyskamy wynik pozytywny metodą ATP, a co najważniejsze taka powierzchnia jest idealną pożywką dla występujących w środowisku mikroorganizmów. 

Jak zostało to przedstawione powyżej, mimo iż metoda pomiaru ATP jest bardzo prosta, należy znać jej mechanizm, aby móc w odpowiedni sposób z niej korzystać i w razie problemów, znaleźć ich przyczynę. Obecnie na rynku mamy duży wybór urządzeń i testów do detekcji ATP. Podczas wyboru luminometru powinniśmy kierować się dwoma parametrami wysoką powtarzalnością i wysoką celnością wyników[5]. Wysoka celność wskaże faktyczny poziom ATP na badanej powierzchni. Wysoka powtarzalność natomiast pozwoli na uzyskanie niemalże tych samych wyników dla tego samego miejsca pomiarowego.

Dlatego też urządzanie do pomiaru ATP powinno być bardzo dokładne, a testy stabilne, aby dać rzetelne wyniki. Zastosowanie np. fotomultipowielacza w urządzeniu 3M™ Clean-Trace™ pomaga w osiągnięciu wysokich wyników w zakresie celności i powtarzalności. Fotopowielacz jest jednym z najczulszych elementów do detekcji światła. Pozwala na wykrycie już 1 fotonu, gdzie ludzkie oko jest w stanie wykryć 100 000 fotonów/sekundę, zaś a fotodiody użyte w innych systemach 10 000 fotonów/sekundę[6]. Dodatkową zaletą luminometru jest to, że możemy go zabrać w dowolne miejsce oraz wykonać pomiar tu i teraz. Co więcej, intuicyjne i przydatne oprogramowanie pozwoli na łatwiejszy dostęp do danych a następnie umożliwi uzyskanie personalizowanego raportu danych.

Podczas wyboru najlepszego rozwiązania dla naszego zakładu produkcyjnego, musimy się zastanowić przede wszystkim co jest dla nas najważniejsze. Intuicyjne oprogramowanie czy może odporne na temperaturę urządzenie? Rynek oferuje nam dużo możliwości. Jedno jest pewne: takie rozwiązanie musi być zgodne z naszymi oczekiwaniami i potrzebami.

Źródła:

[1] Rapid microbiology: applications of bioluminescence in the food industry--a review. Stannard CJ, Gibbs PA.J Biolumin Chemilumin. 1986 Jun;1(1):3-10. doi: 10.1002/bio.1170010103.

[2]  Bioluminescence ATP monitoring for the routine assessment of food contact surface cleanliness in a university canteen. Osimani A, Garofalo C, Clementi F, Tavoletti S, Aquilanti L.Int J Environ Res Public Health. 2014 Oct 17;11(10):10824-37. doi: 10.3390/ijerph111010824.

[3] “Evaluation of Repeatability of Surface ATP Test Devices at Different Environmental Temperatures.” IAFP 2015, Portland, Oregon, US, July 25–28, 2015. Ryan Dias (1), Bethan Rowlands (1), Helen Taylor (1), Janet Holmes (1), Virginia Winter (1) and Mark Driscoll (2). 1. Food Industry Centre, Cardiff Metropolitan University, Cardiff, CF5 2YB, UK. 2. 3M Food Safety Department, 3M Healthcare Limited, The Science Park, Bridgend, CF31 3NA, UK

[4] Evaluation of ATP bioluminescence for monitoring surface hygiene in a hospital pharmacy cleanroom. Tršan M, Vehovc M, Seme K, Srčič S.J Microbiol Methods. 2020 Jan;168:105785. doi: 10.1016/j.mimet.2019.105785.

[5] Griffith, Chris, “What makes a good ATP hygiene monitoring system?”, International Food Hygiene, Volume 22, Number 8, Pages 21–23

[6] Development of a highly sensitive microplate luminometer using ATP bioluminescence. Kawabe S, Uchiho Y.Luminescence. 2020 Dec;35(8):1195-1198. doi: 10.1002/bio.3828.