W ostatnich latach intensywnie poszukiwane są nowe, naturalne i bezpieczne metody ograniczania wzrostu bakterii w żywności, które stanowiłyby alternatywę dla chemicznych konserwantów i pozwoliły na całkowite wyeliminowanie lub ograniczenie stosowania antybiotyków. Hodowcy trzody chlewnej, aby zminimalizować ryzyko infekcji zwierząt, a tym samym przedostania się patogenu do żywności, niestety często decydują się na podawanie im antybiotyków, co przyczynia się do rosnącej lekooporności bakterii. Dużym zainteresowaniem badaczy oraz producentów żywności cieszą się naturalne konserwanty, a wśród nich olejki eteryczne czy ekstrakty roślinne bogate w związki bioaktywne, zwłaszcza polifenole. Do naturalnych substancji przeciwbakteryjnych zaliczane są także wyciągi polisacharydowe oraz peptydy przeciwdrobnoustrojowe. Substancje te charakteryzują się dosyć szerokim spektrum działania, a ich podanie w paszy czy dodanie na etapie produkcji żywności pozwala na ograniczanie rozwoju mikroorganizmów, uzyskanie produktów o lepszej jakości mikrobiologicznej i przedłużenie okresu przydatności do spożycia żywności.

Uwagę badaczy skupiają także bakteriofagi, czyli wirusy zdolne do atakowania komórek bakteryjnych. Znane są lityczne i lizogenne szczepy bakteriofagów, jednakże w przemyśle spożywczym rekomendowane jest użycie tych o właściwościach litycznych. W cyklu lizogenicznym następuje replikacja genomu bakteriofaga bez niszczenia i uszkodzenia komórki gospodarza. W przypadku cyklu litycznego zainfekowana komórka zostaje zabita.

W przeciwieństwie do wymienionych wyżej naturalnych substancji przeciwdrobnoustrojowych, bakteriofagi charakteryzują się jednak wąskim spektrum aktywności i wykazują powinowactwo do konkretnych gatunków bakterii. Działają jedynie na docelową grupę drobnoustrojów, co jest istotne dla produkcji żywności fermentowanej. Zastosowanie bakteriofagów ogranicza się więc głównie do kontroli wzrostu mikroorganizmów patogennych w żywności, takich jak: Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Campylobacter jejuni, Shigella sp., Yersinia enterocolitica, Cronobacter sakazakii. Badania pokazują wysoką skuteczność bakteriofagów do ograniczania wzrostu bakterii, nawet w porównaniu do innych substancji przeciwdrobnoustrojowych. Bakteriofagi powodują śmierć komórek gospodarza i zapobiegają ponownemu zakażeniu. Ponadto nie wpływają negatywnie na cechy sensoryczne żywności.

Wymagania stawiane bakteriofagom

Bakteriofagi stosowane w przemyśle spożywczym muszą spełniać pewne wymagania. Każdy preparat musi być przetestowany pod kątem aktywności przeciwbakteryjnej i stabilności w różnych warunkach środowiska. Po pierwsze, powinny one w jak najwyższym stopniu redukować liczbę bakterii w produkcie i wykazywać jak najszersze spektrum aktywności przeciwdrobnoustrojowej czyli hamować wzrost jak największej liczby szczepów danego gatunku bakterii. Zatem ciekawym rozwiązaniem jest stosowanie preparatów fagowych zawierających kilka bakteriofagów, co zapewnia możliwie szeroki zakres aktywności przeciwbakteryjnej. Niezwykle ważna jest także stabilność fagów. Muszą one wykazywać stabilność w szerokim zakresie pH i temperatury. Produkty spożywcze różnią się miedzy sobą wartością pH, która może się także zmieniać w trakcie przechowywania żywności. Dlatego tak ważne jest aby bakteriofagi nie były wrażliwe na zmieniające się pH środowiska. Należy pamiętać, że wiele produktów spożywczych jest poddawanych obróbce termicznej, dlatego stabilność fagów w szerokim zakresie temperatury jest tak istotna. Jeśli bakteriofagi mają być stosowane wraz z innymi substancjami przeciwdrobnoustrojowymi, należy zbadać wpływ tych substancji na liczbę fagów. Dopuszczalne są jedynie niewielkie zmiany w mianie fagów.

Występowanie Salmonella sp. w żywności

Na podstawie raportu EFSA z 2020 roku, najczęstszą przyczyna zatruć pokarmowych są bakterie Campylobacter sp., a na drugim miejscu znajdują się bakterie Salmonella sp. Źródłem zakażenia Salmonella sp. są woda, gleba, pasza i kał. Bakterie te wykrywa się głównie w mięsie i produktach mięsnych, a także w mleku i przetworach mlecznych, owocach i warzywach, rybach i produktach rybnych oraz jajach i produktach jajecznych. Największy odsetek zarażonych zwierząt stanowią kurczaki, a następnie bydło, indyki, świnie, kaczki i gęsi. Najczęstszą przyczyna infekcji są serotypy Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium (EFSA, 2020).

Bakterie Salmonella sp. są częstym problemem zwłaszcza w fermach drobiu i przemyśle drobiarskim. Dlatego większość opublikowanych dotychczas badań skupia się na biokontroli Salmonella sp. w produktach drobiowych (mięso i jaja). Metody eliminacji Salmonella sp. takie jak chemiczne środki dezynfekujące, obróbka cieplna i obróbka UV, choć skuteczne, nie są całkowicie bezpieczne i mają negatywny wpływ na jakość żywności. Bakteriofagi wydają się więc być ciekawą alternatywą dla dotychczas stosowanych metod zwalczania Salmonella sp.

Zastosowanie fagów w żywności

Należy zaznaczyć, że efektywność działania bakteriofagów w żywności zależy przede wszystkim od matrycy spożywczej, poziomu zanieczyszczenia mikrobiologicznego, miana bakteriofagów czasu ekspozycji, a także temperatury przechowywania produktu. Stężenie bakteriofagów dodawanych do żywności często określa się za pomocą wskaźnika MOI (ang. multiplicity of infection) określającego stosunek liczby fagów do liczby komórek gospodarza (PFU/CFU). Im wyższa wartość MOI, tym większa efektywność działania bakteriofagów.

Demirarslan i in. (2021) badali wpływ fagów (~10⁹ PFU/g) na liczbę Salmonella Enteritidis w mięsie drobiowym zanieczyszczonym bakteriami w ilości ~10³ i ~10⁶ CFU/g. W próbkach o niższym poziomie zanieczyszczenia Salmonella sp. liczba bakterii była poniżej progu detekcji (Salmonella sp. w mięsie. Phontgang i wsp. (2018) wykazali, że liczba bakterii Salmonella Typhimurium w mleku obniżyła się o ponad 3 log CFU/g zarówno po 4 godzinach, jak i 3 dniach inkubacji. Badania wskazują także, że bakteriofagi wraz z innymi substancjami przeciwdrobnoustrojowymi mogą działać synergistycznie. Sukumaran i in. (2015) badali wpływ preparatu fagowego SalmoFresh^TM w połączeniu z chemicznymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi (alginianem laurynowym i chlorkiem cetylopirydyniowym) na liczbę Salmonella sp. w filetach z piersi kurczaka. W ciągu 7 dni przechowywania mieszanki obniżyły poziom bakterii o 0,9-1,4 log CFU/g w porównaniu z kontrolą. SalmoFresh^TM zastosowany oddzielnie obniżył liczbę Salmonella sp. tylko o 0,5-1,1 log CFU/g.

Należy zwrócić uwagę, że w prowadzonych eksperymentach żywność jest sztucznie zanieczyszczona bakteriami Salmonella sp., a ich liczba jest stosunkowo wysoka. W rzeczywistości, poziom patogenu w skażonej żywności jest znacznie niższy. Możliwe jest zatem całkowite zahamowanie wzrostu bakterii. Należy jednak pamiętać, aby stosować wyższe MOI, w celu zwiększenia prawdopodobieństwa kontaktu poszczególnych bakterii z co najmniej jednym fagiem, zwłaszcza w przypadku matrycy stałej.

Oporność bakterii na fagi

Mimo wielu niewątpliwych zalet bakteriofagów, należy zwrócić uwagę, że możliwe jest wykształcenie mechanizmów oporności bakterii na fagi. Znane są trzy rodzaje takich mechanizmów (Egido i wsp., 2022):

• adaptacje receptorów: losowe mutacje lub zmiany fenotypowe w bakteriach, które powodują zmniejszoną adsorpcję fagów,
• systemy obronne gospodarza: szlaki molekularne, które wyewoluowały w bakteriach, aby zapobiegać lub tłumić infekcje fagowe,
• fagowe systemy obronne: szlaki molekularne kodowane przez fagi w celu konkurowania z innymi fagami na korzyść gospodarza.

Niektóre mechanizmy prawdopodobnie nadal pozostają nieodkryte. Jednakże zjawisko oporność bakterii na fagi nie jest obecnie bardzo powszechne. Większym problemem wydaje się być oporność na antybiotyki. Dlatego też, mimo to bakteriofagi wciąż są intensywnie badane jako alternatywa dla leków.

Endolizyny

Endolizyny są to białka o właściwościach enzymatycznych wytwarzane i uwalniane w ostatnich etapach cyklu litycznego bakteriofagów. Endolizyny wykazują właściwości przeciwbakteryjne. Powodują uszkodzenia peptydoglikanu ściany komórkowej, a w konsekwencji śmierć komórki. Endolizyny działające na bakterie Gram-dodatnie posiadają dwie domeny funkcjonalne, domenę odpowiedzialną za ich aktywność katalityczną (EAD – ang. enzymatically active domain) oraz za rozpoznawanie substratu (CBD – ang. cel wall binding domain). Endolizyny działające na bakterie Gram-ujemne posiadają natomiast tylko domenę katalityczną.

Niektóre badania skupiają się na zastosowaniu samych endolizyn (nie bakteriofagów) do kontroli wzrostu mikroorganizmów w żywności. Wykazują one znacznie szersze spektrum działania niż bakteriofagi. Ponadto nie zostało dotychczas opisane zjawisko oporności bakterii na endolizyny. Zhang i in. (2021) w swoich badaniach wykazali przeciwdrobnoustrojową aktywność endolizyny LySTG2 otrzymanej z faga STG2 skierowanego przeciwko S. Typhimurium. Enzym ten hamował wzrost bakterii Gram-ujemnych Salmonella sp., E. coli i Pseudomonas aeruginosa, jednakże nie działał na bakterie Gram-dodatnie. Według Jiang i in. (2021) endolizyna LySSP1 również otrzymana z bakteriofaga skierowanego wobec S. Typhimurium wykazywała działanie antybakteryjnie nie tylko na różne szczepy i serotypy Salmonella sp., ale również na inne gatunki patogennych bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych: E. coli, Shigella sp., i L. monocytogenes.

Mimo szerokiego spektrum działania, endoliyny nadal pozostają jednak niedocenianymi środkami przeciwbakteryjnymi. Istnieje niewiele danych literaturowych na temat ich zastosowania w żywności. Dlatego też niezwykle ważne wydaje się prowadzenie badań nad zastosowaniem endolizyn jako czynników biokontroli wzrostu mikroorganizmów w żywności.

Regulacja prawne

W ostatnich latach wzrasta liczba preparatów fagowych dopuszczonych do użytku. Niektóre z nich posiadają status GRAS (ang. generally recognised as safe), certyfikat koszerności i HALAL oraz mogą być stosowane w żywności ekologicznej. W niektórych krajach np. USA, Brazylii, Holandii, Izraelu, Kanadzie, Szwajcarii, Australi i oraz Nowej Zelandii, preparaty zawierające bakteriofagi zostały zatwierdzone jako pomocnicze środki do zwalczania patogenów w żywności. Dotychczas dopuszczono do użytku trzy preparaty fagowe wobec Salmonella sp.: SalmoFresh^TM, PhageGuard S^TM (wcześniej znany jako Salmonelex^TM), SalmoPro® (Tabela 1). W krajach UE preparaty fagowe nie zostały dotychczas zaakceptowane jako dodatki do żywności, ale jest możliwe, że niedługo to nastąpi.

Tabela 1. Preparaty fagowe wobec Salmonella sp. dopuszczone do stosowania w żywności

Podsumowanie

Bakteriofagi są niewątpliwie skutecznymi środkami przeciwbakteryjnymi wobec Salmonella sp. i innych patogenów występujących w żywności. Z uwagi na rosnącą lekooporność drobnoustrojów, stanowią interesującą dla nich alternatywę. Stosowanie preparatów fagowych jest bezpieczne dla człowieka, poprawia bezpieczeństwo żywności i nie wpływa negatywnie na jej jakość. Ciekawym rozwiązaniem jest też aplikacja samych endolizyn, ale wiedza na ten temat wciąż jest niewielka.

Literatura

[1] European Food Safety Authority, & European Centre for Disease Prevention and Control. (2021). The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal, 19(12), e06971.

[2] Egido, J. E., Costa, A. R., Aparicio-Maldonado, C., Haas, P. J., & Brouns, S. J. (2022). Mechanisms and clinical importance of bacteriophage resistance. FEMS Microbiology Reviews, 46(1), fuab048.

[3] Demirarslan, Ö. A., Alasalvar, H., & Yildirim, Z. (2021). Biocontrol of Salmonella Enteritidis on chicken meat and skin using lytic SE-P3, P16, P37, and P47 bacteriophages. LWT, 137, 110469.

[4] Jiang, Y., Xu, D., Wang, L., Qu, M., Li, F., Tan, Z., & Yao, L. (2021). Characterization of a broad-spectrum endolysin LysSP1 encoded by a Salmonella bacteriophage. Applied Microbiology and Biotechnology, 105(13), 5461-5470.

[5] Phongtang, W., Choi, G. P., Chukeatirote, E., & Ahn, J. (2019). Bacteriophage control of Salmonella Typhimurium in milk. Food science and biotechnology, 28(1), 297-301.

[6] Sukumaran, A. T., Nannapaneni, R., Kiess, A., & Sharma, C. S. (2015). Reduction of Salmonella on chicken meat and chicken skin by combined or sequential application of lytic bacteriophage with chemical antimicrobials. International journal of food microbiology, 207, 8-15.

[7] Zhang, Y., Huang, H. H., Duc, H. M., Masuda, Y., Honjoh, K. I., & Miyamoto, T. (2021). Endolysin LysSTG2: Characterization and application to control Salmonella Typhimurium biofilm alone and in combination with slightly acidic hypochlorous water. Food Microbiology, 98, 103791.