Zakażenia Escherichia coli wytwarzające toksynę Shiga stanowią poważny problem zdrowia publicznego na całym świecie. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, ang. World Health Organization) w 2010 roku bakterie STEC spowodowały ponad milion chorób i 128 zgonów. Aby odpowiednio zapobiegać zakażeniom przenoszonym przez żywność, ważne jest zwiększenie świadomości społecznej na temat potencjalnych źródeł i sposobów przenoszenia patogenów.

Ogólna charakterystyka Escherichia coli

Escherichia coli, często określana w skrócie jako E. coli, to Gram-ujemna bakteria w kształcie pałeczki należąca do rodziny Enterobacteriaceae. Nazwana na cześć Theodora Eschericha, który jako pierwszy wyizolował ją w 1885 r. Escherichia coli jest jedną z najlepiej zbadanych i dobrze poznanych bakterii w mikrobiologii.

To, co sprawia, że Escherichia coli jest szczególnie fascynująca, to jej uniwersalność. Bakteria ta może przystosować się do szerokiego zakresu warunków środowiskowych, rozwijając się w różnorodnych siedliskach, takich jak gleba, woda i przewód pokarmowy zwierząt. Jej zdolności adaptacyjne w połączeniu ze stosunkowo prostym genomem i szybkim tempem wzrostu sprawiają, że E. coli jest nieocenionym organizmem modelowym do badania podstawowych procesów biologicznych i mechanizmów genetycznych.

Chociaż większość szczepów E. coli jest nieszkodliwa, a nawet pożyteczna, to niestety niektóre szczepy są chorobotwórcze i wytwarzają silne cytotoksyny, które hamują syntezę białek w komórkach eukariotycznych. Najlepiej poznaną grupą są szczepy E. coli wytwarzające toksyny typu Shiga (STEC, ang. Shiga Toxigenic E. coli) lub werocytotoksyny (VTEC, ang. Verotoxin producing E. coli).

E. coli wytwarzające toksyny typu Shiga

E. coli wytwarzające toksynę Shiga definiuje się na podstawie ich zdolności do wytwarzania toksyn Shiga (Stx), kodowanych przez geny stx1 i stx2, różniące się między sobą składem aminokwasowym, a także strukturą antygenową. Dodatkowym genem zjadliwości jest gen eae kodujący produkcję intyminy, która ułatwia powstawanie charakterystycznych zmian na komórkach jelitowych.

STEC można różnicować na podstawie somatycznych antygenów O i wiciowych antygenów H na serogrupy (O) lub serotypy (O:H). Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA, ang. The Food and Drug Administration) zidentyfikowała sześć serogrup, znanych jako „wielka szóstka”: E. coli O26, O45, O103, O111, O121 i O145, jednakże występuje więcej serogrup niż te wymienione. Spośród kilku szczepów E. coli, O157:H7 jest najczęściej izolowanym serotypem ze względu na poważne powikłania chorób, za które jest odpowiedzialny.

Aspekty kliniczne i epidemiologia

Najczęstszą chorobą wywołaną przez bakterie STEC jest ostre zatrucie pokarmowe, które może obejmować biegunkę (często krwawą), bóle brzucha, nudności, wymioty i gorączkę. Większość zakażeń przebiega łagodnie i samoistnie ustępuje po kilku dniach. Jednakże u niektórych osób, szczególnie u małych dzieci, osób starszych i osób o obniżonej odporności, zakażenie Shiga E. coli może prowadzić do zespołu hemolityczno-mocznicowego (HUS, ang. Hemolytic-Uremic Syndrome). Jest to rzadkie, ale potencjalnie śmiertelne schorzenie, które charakteryzuje się małopłytkowością, niewydolnością nerek i niedokrwistością hemolityczną. Objawy obejmują zmniejszenie ilości moczu, blednięcie skóry, obrzęki, zmęczenie i zaburzenia świadomości. HUS wymaga pilnego leczenia szpitalnego i może prowadzić do innych poważnych powikłań, takich jak zapalenie ośrodkowego układu nerwowego, encefalopatii, udaru naczyniowo-mózgowego, epilepsji a nawet śmierci.

Naturalnym rezerwuarem STEC jest bydło – ale czy przede wszystkim?

STEC jest szczególnie ważny w kontekście zdrowia publicznego ze względu na jego potencjalne źródło zakażenia w produktach spożywczych. Najczęściej występuje w mięsie, zwłaszcza wołowym, gdzie bakterie mogą przenikać na powierzchnie mięsa podczas uboju zwierząt lub podczas przetwarzania mięsa. Surowe warzywa i owoce mogą być kolejnym źródłem STEC, szczególnie jeśli są one hodowane w warunkach, gdzie gleba lub woda mogą być skażone fekaliami zwierząt. W przypadku warzyw liściastych, takich jak sałata lub szpinak, ryzyko to może być jeszcze większe ze względu na trudności w ich dokładnym umyciu. Co więcej, patogeny STEC mogą pojawić się w salami, niepasteryzowanych produktach mlecznych, produktach zbożowych, niepasteryzowanych sokach, nasionach i kiełkach nasion.

Rysunek. Źródła STEC: zwierzęta, żywność pochodzenia zwierzęcego, żywność pochodzenia roślinnego, środowisko

Wymagania prawne

Dyrektywa 2003/99/WE w sprawie monitorowania chorób odzwierzęcych i odzwierzęcych czynników chorobotwórczych, zmieniająca decyzję Rady 90/424/EWG i uchylająca dyrektywę Rady 92/117/EWG

W Dyrektywie zawarto priorytety zdrowia publicznego określone przez Komitet, wśród których znajdują się w szczególności Salmonella spp., Campylobacter spp., werocytotoksyczne Escherichia coli (VTEC), Listeria monocytogenes, Cryptosporidium spp., Echinococcus granulosus/multilocularis i Trichinella spiralis.

Główne punkty dyrektywy obejmują:

• Monitorowanie i kontrole: Dyrektywa nakłada obowiązek na państwa członkowskie UE, aby zbierały odpowiednie i porównywalne dane w celu określenia i scharakteryzowania zagrożeń i ryzyka związanego z chorobami odzwierzęcymi.
• Śledzenie i identyfikacja ognisk przenoszonych przez żywność: Państwa członkowskie zobowiązane są do śledzenia i identyfikowania źródeł (STEC) w żywności oraz podejmowania działań prewencyjnych i kontrolnych w celu zapobiegania ich wystąpienia.
• Współpraca i wymiana informacji: Dyrektywa wymaga, aby państwa członkowskie współpracowały i wymieniały informacje na temat monitorowania, kontroli i działań podejmowanych w zakresie żywności.

Rozporządzenie Komisji (UE) nr 209/2013 z dnia 11 marca 2013 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 w odniesieniu do kryteriów mikrobiologicznych dotyczących kiełków i zasad pobierania próbek z tusz drobiowych i świeżego mięsa drobiowego.

Jest to akt prawny Unii Europejskiej, który dotyczy środków higieny żywnościowej stosowany w odniesieniu do bakterii Escherichia coli produkujących toksynę Shiga oraz wprowadzający specjalne wymagania dotyczące środków kontrolnych kiełków niepoddanych obróbce na obecność szczepów E. coli wytwarzających toksynę Shiga – serotypy: O157, O26, O111, O103, O145 oraz O104:H4 (wymagania – nieobecne w 25 g i w 5 próbkach). Rozporządzenie to zostało przyjęte w kontekście zagrożenia zdrowia publicznego związanego z zakażeniami STEC i ma na celu zapobieganie rozprzestrzenianiu się tych bakterii oraz ograniczanie ryzyka dla konsumentów.

Główne punkty dotyczące STEC rozporządzenia obejmują:

• Zalecenie zaostrzenia kryteriów mikrobiologicznych jako jeden z elementów systemu zarządzania bezpieczeństwem żywności w odniesieniu do łańcucha produkcji skiełkowanych nasion.
• Zalecenie badania pod kątem obecności czynników chorobotwórczych wszystkich partii nasion, w przedsiębiorstwach sektora spożywczego, w których nie wprowadzono systemów zarządzania bezpieczeństwem żywności.
• Ustalenie częstotliwości pobierania próbek nie mniejszej niż raz na miesiąc, nie wcześniej niż 48 godzin po rozpoczęciu procesu kiełkowania.

WETERYNARIA – WYMAGANIA DLA ZAKŁADÓW SEKTORA MIĘSA WOŁOWEGO I DROBIOWEGO ZATWIERDZONYCH DO EKSPORTU NA RYNEK IZRAELA; Serogrupy E.coli: O157:H7, O26, O45, O103, O111, O121, O145.

PUBLIC HEALTH ENGLAND 2018; Serogrupy E.coli: O157, O26, O91, O117, O128, O146.

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) BR 209/2013; Serogrupy E. coli: O157, O26, 0103, O104:H4, O111, O145.

TZW. WIELKA SZÓSTKA + O157 (USA); Serogrupy E. coli: O157, O26, O45, O103, O111, O121, O145.

ECDC RAPORT 2019; Serogrupy E.coli: O157, O26, O91, O103, O146.

ISO/TS 13136:2012; Serogrupy E.coli: O157, O26, 0103, 0111, O145.

Metody detekcji Escherichia coli STEC

Wykrywanie Shiga E. coli w próbkach żywności ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania epidemii i zapobiegania dalszemu rozprzestrzenianiu się. Do identyfikacji obecności genów toksyny Shiga lub samej toksyny powszechnie stosuje się techniki laboratoryjne, w tym reakcję łańcuchową polimerazy (PCR, ang. Polymerase Chain Reaction). Badanie rozpoczyna się od naważenia próbki i dodania odpowiedniej ilości rozcieńczalnika mTSB (ang. Modified Trypton – Soy broth) lub BPW (ang. Buffered Peptone Water). Po homogenizacji i inkubacji w temperaturze 37°C ± 1°C przez czas 18-24 godzin wykonuje się ekstrakcję DNA. Badania detekcji Escherichia coli podzielone są na 3 etapy:

1. Screening, czyli wykrywanie obecności genów stx1, stx2, eae w próbce.
   • Jeśli geny coli STEC są nieobecne: oznacza to, że w badanej próbce nie wykryto E. coli STEC (w tym żadnego z serotypów). W takim przypadku wynik przedstawiany jest jako: nie wykryto E. coli STEC w danej masie/objętości/ powierzchni próbki.

Badanie zostaje zakończone na tym etapie. W przypadku braku genów stx procedurę przerywa się bez przystąpienia do oznaczania genu eae lub genów związanych z grupami serologicznymi objętymi tą metodą.

• Jeśli geny coli STEC są obecne: oznacza to, że w badanej próbce wykryto geny E. coli STEC, ale nie ma pewności, że obecny jest żywy patogen. W takim przypadku wynik przedstawiany jest jako: przypuszczalne wykrycie E. coli STEC w danej masie/ objętości/ powierzchni próbki.

Jeśli z pierwszego etapu badania otrzymamy wynik przypuszczalnego wykrycia E. coli STEC, możliwe jest zakończenie badań na tym etapie i wydanie raportu z badań lub wykonanie kolejnych etapów (wykrywania DNA poszczególnych serotypów E. coli STEC i/lub potwierdzenia obecności żywych drobnoustrojów).

2. Wykrywanie DNA serotypów STEC, czyli obecności genów poszczególnych serogrup werotoksycznej coli STEC w próbce.
   • Jeśli geny danej serogrupy coli STEC nie zostały wykryte to oznacza, że w badanej próbce nie wykryto E. coli STEC z żadnej z wymienionych serogrup: O157, O111, O26, O103, O145, O104, O121, O45, O157:H7. Wtedy wynik przedstawiany jest jako: nie wykryto E. coli STEC O157:H7 w danej masie/ objętości/ powierzchni próbki.
   • Jeśli w próbce wykryto geny charakterystyczne dla danej serogrupy coli STEC (O157, O111, O26, O103, O145, O104, O121, O45, O157:H7) wynik przedstawiany jest jako: przypuszczalne wykrycie E. coli STEC serogrupa X (np. O157:H7) w danej masie/ objętości/ powierzchni próbki.
3. Potwierdzenie obecności STEC i serotypów, czyli etap polegający na potwierdzeniu obecności w próbce żywych drobnoustrojów, zawierających geny charakterystyczne dla coli STEC (stx1/stx2) oraz poszczególnych serogrup.
   • Jeśli obecność drobnoustrojów zawierających geny charakterystyczne dla coli STEC i/lub danej serogrupy zostanie potwierdzona w badanej próbce, oznacza to, że w próbce obecne są żywe komórki E. coli STEC (lub E. coli STEC wskazanych serogrup). W takim przypadku wynik przedstawiany jest jako: E. coli STEC obecne w danej masie/ objętości/ powierzchni próbki lub E. coli STEC serogrupa X (np.: O157:H7) obecne w danej masie/ objętości/ powierzchni próbki.
   • Jeśli obecność drobnoustrojów zawierających geny charakterystyczne dla coli STEC i/lub danej serogrupy nie zostanie potwierdzona w badanej próbce, oznacza to, że nie wyizolowano żywych komórek E. coli STEC (lub E. coli STEC wskazanych serogrup). W takim przypadku wynik przedstawiany jest jako: przypuszczalne wykrycie E. coli STEC serogrupy X (np.: O157:H7) w danej masie/ objętości/ powierzchni próbki.

Podsumowanie

Zapobieganie zanieczyszczeniu Shiga E. coli rozpoczyna się od dobrych praktyk w zakresie higieny i bezpieczeństwa żywności. Dokładne gotowanie mięsa, pasteryzacja produktów mlecznych oraz prawidłowe obchodzenie się z owocami i warzywami może znacznie zmniejszyć ryzyko infekcji. Ponadto wdrożenie rygorystycznych środków sanitarnych w zakładach przetwórstwa żywności i utrzymanie praktyk higienicznych w gospodarstwach, może pomóc w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się bakterii. Monitorowanie produktów żywnościowych, tusz zwierząt rzeźnych, czy środowiska produkcyjnego jest kluczem do sukcesu w celu zapobiegania rozprzestrzeniania się STEC. Firma ALS Food&Pharmaceutical Polska Sp z o.o. umożliwia producentom żywności zbadanie próbek w kierunku wykrywania obecności DNA Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga oraz wskazanych w niniejszym artykule serogrup. Badania są objęte zakresem akredytacji, przeprowadzane wg normy ISO/TS 13136:2012.

Bibliografia

[1] Pires, S. M., Majowicz, S., Gill, A., & Devleesschauwer, B. (2019). Global and regional source attribution of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections using analysis of outbreak surveillance data. Epidemiology and infection, 147, e236.

[2] Lim, J. Y., Yoon, J., & Hovde, C. J. (2010). A brief overview of Escherichia coli O157:H7 and its plasmid O157. Journal of microbiology and biotechnology, 20(1), 5–14.

[3] Foster-Nyarko, E., & Pallen, M. J. (2022). The microbial ecology of Escherichia coli in the vertebrate gut. FEMS microbiology reviews, 46(3), fuac008.

[4] Wang, Y., Hart-Cooper, W. M., Rasooly, R., Carter, M. Q., Orts, W. J., Gu, Y., & He, X. (2022). Effect of an Eco-Friendly Cuminaldehyde Guanylhydrazone Disinfectant on Shiga Toxin Production and Global Transcription of Escherichia coli. Toxins, 14(11), 752.

[5] Fagan, P. K., Hornitzky, M. A., Bettelheim, K. A., & Djordjevic, S. P. (1999). Detection of shiga-like toxin (stx1 and stx2), intimin (eaeA), and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) hemolysin (EHEC hlyA) genes in animal feces by multiplex PCR. Applied and environmental microbiology, 65(2), 868–872.

[6] Alharbi, M. G., Al-Hindi, R. R., Esmael, A., Alotibi, I. A., Azhari, S. A., Alseghayer, M. S., & Teklemariam, A. D. (2022). The "Big Six": Hidden Emerging Foodborne Bacterial Pathogens. Tropical medicine and infectious disease, 7(11), 356.

[7] Besbas N., Karpman D., Landau D. i wsp.; European Paediatric Research Group for HUS. A classification of hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura and related disorders. Kidney Int. 2006; 70: 423–443.

[8] FAO and WHO. 2022. Control measures for Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) associated with meat and dairy products – Meeting report. Microbiological Risk Assessment Series No. 39. Rome.

[9] Dyrektywa 2003/99/WE w sprawie monitorowania chorób odzwierzęcych i odzwierzęcych czynników chorobotwórczych, zmieniająca decyzję Rady 90/424/EWG i uchylająca dyrektywę Rady 92/117/EWG

[10] Rozporządzenie Komisji (UE) nr 209/2013 z dnia 11 marca 2013 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 w odniesieniu do kryteriów mikrobiologicznych dotyczących kiełków i zasad pobierania próbek z tusz drobiowych i świeżego mięsa drobiowego.

[11] Oferta dla Klientów przygotowana przez Kierownictwo Laboratorium mikrobiologicznego ALS Poznań

 TEN ARTYKUŁ JEST CZĘSCIĄ OPRACOWANIA FOODFAKTY NAWIGATOR, KTÓRY DOSTĘPNY JEST DO POBRANIA ZA DARMO DZIĘKI PARTNEROM MERYTORYCZNYM WARSZTATÓW I FORUM WIEDZY MANAGERSKIEJ FOODFAKTY SCIENCE 4 BUSINESS -  ZAGROŻENIA MIKROBIOLOGICZNE I BIOLOGICZNE ŻYWNOŚCI ORAZ INNE UZUPELNIAJĄCE ZAGADNIENIA (4-5 WRZEŚNIA 2024, ŁÓDŹ)